黃芪甲苷通過抑制卵泡顆粒細胞凋亡緩解糖尿病雌鼠生殖損傷

任雪華，文 揚，虞 蓮，田佳卉，雷安民*

(1.西北農林科技大學動物醫學院/陜西省干細胞工程技術研究中心，陜西楊凌 712100；2.西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100)

糖尿病作為一種慢性代謝性疾病，全球有超過6%的人口受到影響[1]。據國際糖尿病聯合會報告，2019年全世界估計有4.63億成年人患有糖尿病，預計2045年將上升到7億。糖尿病患者體內高水平的血糖會對各種器官的結構和功能產生有害影響[2-3]。高血糖導致活性氧(reactive oxygen specie，ROS)的過量產生會促使細胞發生氧化應激進而對組織造成損傷。臨床研究發現，糖尿病對女性卵巢功能的影響主要包括初潮延遲，多囊卵巢綜合征，月經不調，無排卵和更年期提前以及卵母細胞質量下降[4]。另外，越來越多的動物模型表明，糖尿病會導致卵母細胞的內質網異常再分配，線粒體功能障礙，減數分裂裝置解體，透明帶厚度減小以及卵母細胞的表觀遺傳變化等問題[5-7]，從而表現出糖尿病小鼠卵巢儲備下降[8]，卵母細胞質量下降和早期胚胎發育受損[9]。

黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ)是提取自黃芪的三萜皂苷類單體成分，是黃芪主要的有效成分。藥理學研究顯示，黃芪甲苷具有降血糖、保護肝臟、充當利尿劑、并具有抗氧化、抗衰老、抗壓力、抗高血壓和廣泛的抗菌性能[10-11]。藥物動力學研究結果表明，小鼠在服用黃芪甲苷后，可以在腸道內轉化為環黃芪醇[12]，環黃芪醇在體外被證明擁有抗氧化功能并且能激活端粒酶保護端粒[13-14]，而端粒長度與細胞增殖能力成正比，即端粒酶的激活可以增加細胞的增殖能力，抵抗細胞的凋亡[15]。

本研究通過使用鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)制造1型糖尿病(type 1 diabetes，T1D)模型小鼠，并按每次50 mg/kg對小鼠進行黃芪甲苷灌胃，每天2次，持續1周[16]。通過統計比較各組卵母細胞體內外發育情況、卵巢組織結構來探究灌胃黃芪甲苷對1型糖尿病雌鼠生殖系統的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡～8 周齡ICR系雌性小鼠，購自維通利華試驗動物有限公司。

1.1.2 主要試劑 黃芪甲苷、鏈脲佐菌素，麥克林公司產品；Milrinone、M2培養基、TritonX-100、PBS、蘇木精、伊紅、礦物油、檸檬酸鈉、檸檬酸，Sigma-Aldrich 公司產品；免疫熒光染色封閉液、免疫熒光染色一抗稀釋液、免疫熒光染色二抗稀釋液、免疫熒光染色抗熒光淬滅劑、α-Tubulin抗體、FITC標記的山羊抗鼠二抗、Tunel凋亡檢測試劑盒、DAPI，碧云天生物技術有限公司產品；人絨毛膜促性腺激素(hCG，180428)、孕馬血清(PMSG，120727)，寧波三生藥業有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 血糖儀(GA-3)、一次性使用末梢采血針，三諾生物傳感股份有限公司產品；二氧化碳培養箱，Thremo Fisher Scientific公司產品；體式顯微鏡，Olympus公司產品；熒光相差倒置顯微鏡、恒溫加熱臺，Leica公司產品；電子天平，Mettler Toledo公司產品。

1.2 方法

1.2.1 雌性TID模型鼠制備 購買6周齡～8周齡體重在25 g以上的ICR雌鼠進行試驗，試驗前進行適應性喂養2周，藥物注射前隔夜禁食。將STZ用0.1 mol/L pH為4.2的檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖溶液溶解，并按照每只230 mg/kg進行腹腔注射。給與充分的飼料與凈水飼養3 d。3 d后空腹一晚，次日尾靜脈采血并用血糖儀檢測血糖，血糖值高于17 mmol/L的小鼠可以被認定為造模成功。對于造模不成功的小鼠，可按STZ 100 mg/kg再次腹腔注射造模。

1.2.2 實驗動物分組與藥物灌胃 將造模成功小鼠隨機分成模型組(TID)和治療組(TID+AS-Ⅳ)，每組20只小鼠，另取20健康ICR雌性小鼠作為對照組。將黃芪甲苷用生理鹽水配制成3.75 mg/mL的灌胃液，4 ℃保存，使用前室溫平衡。每日早晚2次灌胃給藥，空白對照組不進行灌胃，模型組灌胃等量生理鹽水，治療組按體重50 mg/kg灌胃黃芪甲苷溶液，持續1周。

1.2.3 卵母細胞收集與培養 采集GV期卵母細胞前44 h～46 h 按10 IU/只劑量對小鼠腹腔注射PMSG超數排卵。頸部脫臼處死小鼠取出卵巢，在體式顯微鏡下，用小鑷子固定卵巢，通過1 mL注射器針頭撕破卵巢上的卵泡，待卵巢上所有卵泡均被撕破后，用撿卵針迅速將卵丘-卵母細胞復合體(cumulus oocyte complexes,COCs)移入含有2.5 μmol/L Milrinone的M2培養基中放入培養箱，4 h后統計生發泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)率，12 h后統計第一極體(polarbody 1,PB1)率。

采集MⅡ卵母細胞前44 h～46 h按每只10 IU劑量對小鼠腹腔注射PMSG進行超數排卵，12 h～14 h前按每只10 IU劑量腹腔注射hCG促進卵母細胞排出。頸部脫臼處死小鼠取出其左右兩側的輸卵管，在體式顯微鏡下通過1 mL注射器針頭將膨大的輸卵管壺腹部撕破，從而使得卵母細胞排出，用稍粗的撿卵針迅速將釋放出來的COCs移入M2培養基中培養備用。

1.2.4 卵母細胞免疫熒光 分別收集各組GV期培養12 h后的卵母細胞，在10 mg/mL的PFA中4 ℃過夜固定；用PBS緩沖液洗滌3次，移入5 mL/L的Triton X-100 中室溫透膜20 min；PBS洗滌3次，轉入免疫熒光封閉液中室溫封閉1 h；PBS洗滌3次，移入一抗(1∶200)中4 ℃孵育過夜；之后將卵母細胞在PBS中漂洗3次，每次5 min，移入二抗(1∶2 000)中室溫避光孵育2 h；PBS漂洗3次，每次5 min，隨后將卵母細胞移入Hoechst 33342中室溫避光孵育5 min；PBS漂洗3次，每次5 min，將卵母細胞移入用凡士林劃線并具有抗熒光淬滅劑的載玻片小格中，封片，最后用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 卵巢石蠟切片制作與HE染色 小鼠斷頸處死后，取出卵巢，PBS清洗，投入40 mg/mL的PFA中，過夜固定。將固定好的卵巢梯度脫水。隨后將卵巢用二甲苯透明處理。處理好的卵巢在60 ℃烘箱中浸蠟，并調整好卵巢位置進行包埋。包埋好的蠟塊在超薄切片機上切片，厚度一般為 5 μm～7 μm。將切好的切片在45 ℃預熱的展片機上展片，待展開后用黏附載玻片撈取切片，并在顯微鏡下鏡檢，挑選形態結構清晰的切片并用鉛筆在載玻片上相應位置標記，并進行脫蠟與復水，將復水后的切片用蘇木精處理8 min，自來水浸泡藍化20 min，伊紅染液3 min，隨后脫水。染完的切片用樹膠封片并在顯微鏡下觀察。

1.2.6 卵巢切片Tunel凋亡檢測 在脫蠟與復水的切片上滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K，置于濕盒中 37 ℃作用30 min。在避光環境下，向組織上滴加50 μL 配制好的Tunel反應液，于濕盒中37 ℃避光孵育60 min。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。激發波長范圍為450 nm～500 nm，發射波長范圍為515 nm～565 nm(綠色熒光)。

1.2.7 活性氧(ROS)檢測 用卵母細胞體外操作液MEM稀釋DCFH-DA使其終濃度為10 μmol/L，將培養的卵母細胞移入此檢測液中清洗3遍，并移入新的檢測液中，放置于二氧化碳培養箱中孵育20 min，隨后用PBS清洗卵母細胞3遍后，將卵母細胞移入帶有抗熒光猝滅劑并用凡士林劃好小格的切片中，蓋上蓋玻片后在熒光顯微鏡下觀察。熒光強度的灰度值分析用Image J進行。

1.2.8 數據分析 每個統計至少3個生物學重復，每個重復是由一個獨立的試驗在不同的時間完成。熒光強度用Image J進行分析，試驗數據使用GraphPad Prism 6.0進行方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 黃芪甲苷對T1D雌鼠卵母細胞發育能力的影響

T1D模型小鼠制備與藥物處理時間如圖1所示。對成功建模的模型小鼠進行超數排卵，收集各組各時期的卵母細胞，其卵母細胞形態以及各個階段卵母細胞數量如圖2所示。T1D雌性小鼠的MⅡ期卵母細胞在形態上與正常卵母細胞相比有明顯的差距，其胞質碎片增多，并且透明帶形態也不完整(圖2A)。在使用黃芪甲苷灌胃后，治療組雌鼠排卵數相較模型組T1D雌鼠有了大的提升，每只12.6枚±1.7枚，顯著高于模型組每只1.6枚±1.2枚(P<0.05)，并且卵母細胞形態接近于對照組雌鼠。同時發現灌胃黃芪甲苷也可以提高T1D雌鼠GV期卵母細胞體外發育能力，治療組GVBD率為32.9±5.9、PB1率為13±4.1，均高于模型組GVBD率(13±2.3)、PB1率(0.8±0.79)(P<0.05)(圖2B、圖2C、圖2D)。這說明黃芪甲苷處理可以挽救T1D雌性小鼠的生殖潛力，幫助其改善高血糖對卵巢的損傷，恢復卵巢一定的功能。

圖1 模型小鼠藥物處理示意圖

2.2 黃芪甲苷對T1D雌鼠卵母細胞紡錘體及ROS水平的影響

為了進一步探究黃芪甲苷改善T1D雌鼠生殖潛力的機理，將各組收集的GV期卵母細胞體外培養12 h，通過DAPI與Tubulin免疫熒光染色觀察各個組的紡錘體形成情況。如圖3A所示，對于T1D組，其紡錘體形成似乎受到了抑制，這可能是T1D組體外發育過程中沒有卵母細胞發育到MⅡ期的原因。但對于黃芪甲苷處理組，雖然成功形成了紡錘體，但其紡錘體形態相較于正常組更為短小，而且染色體排列也不均勻。同時，收集了GV、GVBD、PB1三個時期的卵母細胞，并對其進行了ROS染色，結果如圖3B所示。通過量化熒光強度，發現模型組GV期卵母細胞的ROS含量高于其他組，而后熒光強度快速下降；治療組的ROS水平在GVBD期較GV期上升，且高于其他2組，在PB1時期又下降；而對照組的ROS水平從GV期開始上升，在PB1期高于其他2組。這說明T1D雌鼠與正常小鼠卵母細胞ROS的變化規律不同，而黃芪甲苷可以改變這種差異。由于細胞內ROS的產生與線粒體活性相關這可能在暗示T1D會使得卵母細胞中線粒體提前進入激活狀態，而黃芪甲苷則會推遲T1D的這種作用。由于在卵母細胞成熟過程中，第一次減數分裂阻滯依賴于顆粒細胞cGMP進入卵母細胞[17]。因此，推測這種異常的激活可能與顆粒細胞相關。

A.MⅡ期卵母細胞形態；B.MⅡ期卵母細胞數量；C.PB1率；D.GVBD率。比例尺100 μm。*(P<0.05)，**(P<0.01)

A.體外培養12h后，各組卵母細胞Tubulin與DAPI染色；B.各組卵母細胞各個階段DCFH-DA染色；C.各組DCFH-DA染色后熒光強度。比例尺100 μm

2.3 黃芪甲苷對T1D雌鼠卵巢結構的影響

為了驗證前面所提出的是顆粒細胞異常導致卵母細胞異常激活，從而引發T1D雌鼠生殖缺陷的推測，采集了3組雌鼠的卵巢并通過HE染色與凋亡染色進行了探究，結果如圖4所示。從圖4A～圖4C可以發現，對于T1D雌鼠卵巢而言，幾乎沒有格拉夫氏卵泡與黃體。這與前面模型組MⅡ期排卵數數據顯示的結果一致，模型組雌鼠幾乎不排卵。通過進一步觀察卵巢上的顆粒細胞，發現如圖4E所示，對于T1D雌鼠，卵泡中卵母細胞上的顆粒細胞層數要明顯少于對照組D和治療組F。由于高糖介導細胞凋亡已有眾多的報道，據此我們推測這種顆粒細胞層數的減少可能與顆粒細胞的異常凋亡有關，為了驗證這個猜想，我們對卵巢組織進行了Tunel凋亡染色，如圖4G～圖4J所示，通過Tunel凋亡染色,發現T1D雌鼠卵巢中顆粒細胞異常凋亡卵泡所占比例遠高于對照組G和治療組I。

A～F.卵巢切片的HE染色圖；G～I.卵巢切片的Tunel染色圖；J.各組凋亡卵泡數與總卵泡數比值。A、B、C比例尺為1 mm；D、E、F比例尺為100 μm；G、H、I比例尺為50 μm。**(P<0.01)

3 討論

在前人對糖尿病導致卵母細胞損傷的研究中，發現對于糖尿病小鼠而言，其排卵數量明顯較少，卵母細胞ROS含量上升，表觀遺傳發生改變，后續發育潛力受損[18]，在本研究也重現了這一點。有趣的是在對T1D雌鼠卵母細胞抑制過程的研究中，發現對于T1D雌鼠卵母細胞，其極易被阻滯在GV期，并且細胞核和細胞質出現了明顯不統一的發育節奏，這可能是其卵母細胞發育不良的重要原因。另外，高血糖使得細胞內ROS的上升[19]，如圖3B所示，T1D雌鼠的GV期卵母細胞相較于對照組與黃芪甲苷治療組其在GV期時就表現出高的ROS水平，而正常組卵母細胞ROS水平要到PB1之后才有明顯升高，這說明對于T1D雌鼠而言，其胞質內的線粒體在其啟動減數分裂以前就已充分激活。在關于ROS與細胞周期的研究中，人們發現ROS會使得細胞內一些關鍵性的蛋白如MAPKS異常的磷酸化，而這些蛋白的磷酸化會使得一些細胞內通路的異常開啟或者關閉，從而引發細胞周期的紊亂等，如MAPK通路的持續激活就可以使得停滯在G1期[20]。此外，ROS含量與DNA損傷也息息相關，端粒DNA被認為特別容易受到ROS介導的切割和堿基修飾的影響[21]，從而造成DNA損傷進而激活了p53蛋白的活性，上調周期激酶抑制劑p21蛋白的水平或者凋亡通路蛋白水平，最終導致細胞G2/M期阻滯甚至細胞凋亡。顆粒細胞在卵母細胞減數分裂恢復中也發揮著重大作用，顆粒細胞中的cGMP能夠進入卵母細胞抑制cAMP-磷酸二酯酶活性，維持cAMP濃度，并使細胞質成熟促進因子(maturation promoting factor,MPF)處于非活化態，維持減數分裂阻滯，在T1D雌鼠中我們觀察到其卵泡中的顆粒細胞凋亡比例要遠遠高于正常組，因此這種T1D雌鼠的提前激活也可能是由于其顆粒細胞過度凋亡而引起的。采用黃芪甲苷治療T1D雌鼠，可以發現對比模型組，治療組在GV期的ROS含量雖然比正常組要稍微高一點，但是卻比模型組要低，提示黃芪甲苷可以通過減少細胞內ROS的積累從而減少ROS對細胞周期的影響。且黃芪甲苷灌胃之后卵泡顆粒細胞的凋亡明顯較少，這也助于抑制因顆粒細胞凋亡引發的卵母細胞激活。除此之外，黃芪甲苷的體內代謝物環黃芪醇是目前已知的一種端粒酶激活劑，其可以在體外培養的細胞中激活端粒酶從而修復因細胞分裂或者外部影響導致的端粒變短與受損[22]。據此推測環黃芪醇在這個過程中可能也起到了一定的作用。

在本研究中，通過鏈脲佐菌素建立T1D雌鼠模型，并對模型小鼠進行黃芪甲苷灌胃，研究黃芪甲苷對T1D雌鼠生殖系統的影響。結果發現黃芪甲苷可以抵抗T1D對小鼠卵巢造成的損傷，但是并不能完全的逆轉，其可能是通過幫助顆粒細胞抵抗凋亡而實現的。本試驗研究黃芪甲苷對糖尿病小鼠雌性生殖系統的影響，一方面能為臨床上應用黃芪甲苷治療糖尿病奠定基礎，另一方面也為黃芪甲苷對糖尿病的治療效果以及作用機理研究提供新的理論依據。