基于LAMP技術檢測速凍肉糜類制品中單增李斯特菌的增菌方法研究及應用

岳慧敏，李海鑫，羅瑞平，趙 亮,4,

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院, 北京 100083；2.中國農業大學（興化）健康食品產業研究院, 江蘇興化 225700；3.泰州安井食品有限公司, 江蘇興化 225700；4.食品質量安全北京實驗室, 食品科學與營養工程學院, 中國農業大學, 北京 100083）

速凍肉糜類制品即我們熟知的“火鍋料制品”，是速凍調制食品中的一大類別，其主要原料為畜禽肉、水產品及其制品[1-3]。我國是速凍肉糜類制品產銷大國，其市場銷售規模由2010年160億元提升至2017年近273億元，復合年均增長率為8%[4]。隨著食物結構和食物消費的變化，速凍肉糜類制品市場規模還將不斷擴大[5]。然而速凍肉糜類制品在加工過程熱處理強度低且儲運過程需要冷鏈支持，具有較高的微生物污染風險[6-7]。研究發現，單核細胞增生李斯特氏菌是速凍肉糜類制品中的主要食源性致病菌，據調查顯示，此類產品的原料污染率高，生肉中單增李斯特菌檢出率為19.1%[8]，海產品中檢出率為31%[9]。在生產、食用過程中加熱不足則易存活，引發食物中毒[10-12]。因此開展單增李斯特菌的檢測對速凍肉糜類制品安全保障具有重要意義[13-15]。

目前我國常用的檢驗方法是傳統培養檢測法，該方法準確度高，但其操作復雜，檢測時間長，檢測結果滯后性不能滿足食品中，尤其是加工環節樣本的單增李斯特菌的快速檢測和追溯[15-16]。因此需要建立一種速凍肉糜類制品中單增李斯特菌的快速檢測方法。檢測食品中單增李斯特菌的快速檢測方法有聚合酶鏈式反應（PCR）、環介導等溫擴增技術（LAMP）、酶聯免疫吸附法（ELISA）及相關改良方法等。其中，環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification），簡稱LAMP，具有快速簡便、成本低、特異性強等優點[17-19]，已在食源性致病菌的快速檢測中得到廣泛應用[20-25]。對于食品中單增李斯特菌的LAMP檢測，在乳制品[26]、生雞肉樣品中[27]已有報道，然而針對速凍肉糜類制品的研究甚少。作為一種速凍調理肉制品，其中復雜成分對增菌、DNA提取、后續LAMP反應的影響尚不明確。本研究基于已建立的速凍肉糜類制品單增李斯特菌LAMP檢測技術基礎上，通過四種增菌培養基的比較，篩選出一種增殖效果最佳的增菌培養基，以降低LAMP方法的檢出限，并實現單增李斯特菌LAMP檢測方法在速凍肉糜類制品中的應用，預期一個工作日完成檢測，以期為食品企業快速檢測速凍肉糜類制品中單増李斯特菌提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，FSCC 178006/ATCC 19115 ） 廣東環凱微生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、SYBR Green I （10000×）、6×DNA 電泳 Loading Buffer 北京天根生化科技有限公司；含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）、李氏菌增菌肉湯（LB1，LB2）基礎、Half-Fraser培養基、Fraser培養基

青島海博生物技術有限公司；Bst 2.0 DNA Polymerase（8000 U/mL）、dNTP Mixture、Gelred核酸染料、DEPC水 北京言必信科技有限公司；雞小胸原料、親親腸（速凍機入口處）、親親腸（速凍機出口處）、包心魚丸（速凍機入口處）、包心魚丸（速凍機出口處） 樣本采集自速凍肉糜類制品工廠生產線；速凍肉糜類樣品 具體采樣信息如表1所示。

表1 樣本種類及數量Table 1 Type and number of samples

1300 SERIES A2生物安全柜 美國Thermo Fisher Scientific公司；ZDX35BI自動高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；THZ-C恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠；DNP-9082電熱恒溫培養箱、DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；Infinite?M200 Pro多功能酶標儀 瑞士TECAN公司；SILVER拍擊式均質機 西班牙IUL公司；165-8001電泳儀、Sub-Cell?GT水平電泳槽 美國Bio-rad公司；ChampGel 5000全自動凝膠成像儀 北京賽智創業科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養 將-80 °C保藏的甘油菌種用TSBYE液體培養基活化，于恒溫振蕩器中37 °C，220 r/min培養8 h，連續活化至第三代作為實驗用培養液。

1.2.2 人工污染不同濃度菌液樣品的制備 用于人工污染的速凍肉糜類樣品經GB 4789.30-2016檢測證實不含有單增李斯特菌。在生物安全柜中無菌操作，取速凍肉糜類樣品25 g加入到含225 mL的TSB-YE 液體培養基的均質袋中，在拍擊式均質機上連續均質2 min，此溶液即為速凍肉糜類樣品均質液。

依據國標和ISO標準[28]，本實驗選用LB1、LB2、Fraser和Half-Fraser四種增菌培養基作為篩選對象，將已知濃度的初始菌液（6.4×109CFU/mL）通過10倍梯度稀釋，首先制備濃度分別為6.4×104～6.4×102CFU/mL的菌液。

然后取上述不同濃度的初始菌液1 mL分別加入到9 mL速凍肉糜類樣品均質液中，混合均勻后分別接種到 90 mL四種增菌培養基中，使增菌培養基中的菌液終濃度分別大于102CFU/mL（640 CFU/mL）、101CFU/mL（64 CFU/mL）、小于10 CFU/mL（6.4 CFU/mL），于恒溫振蕩器中 37 °C培養。

以OD600nm值和平板計數活菌數為檢測指標，在2、4、6、8 h監測目標菌的生長情況。

1.2.3 基因組 DNA 提取 使用細菌基因組提取試劑盒（TIANGEN）提取DNA，按照說明書進行操作。

1.2.4 LAMP反應操作程序 LAMP反應體系：外引物：內引物濃度比 1:4，Mg2+濃度為 6 mmol/L，dNTPs濃度 1.4 mmol/L，Bst DNA聚合酶濃度為800 U/mL，DNA 模板，無酶無菌水，體系 25 μL。選擇hly A基因作為靶基因[29]，引物序列如表2所示。

表2 LAMP引物序列[29]Table 2 Sequences of LAMP primers[29]

加入各反應物于200 μL離心管中，混合均勻，在 61 °C 恒溫水浴鍋中反應 40 min。取產物 5 μL與1 μL Loading Buffer混合均勻，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察特征性電泳圖譜，同時在產物中加入1 μL SYBR Green I熒光染料[30]，觀察顏色變化。

1.2.5 增菌時間的確定 當接種量為64 CFU/mL時，在Half Fraser培養基增菌過程中，分別取0、2、4、6、8 h的菌液，提取DNA模板后，LAMP方法檢測，以電泳檢測出現梯形條帶及SYBR Green I 熒光染料呈現陽性綠色為檢測指標，確定該方法的最短增菌時間。

1.2.6 增菌優化前LAMP檢出限評價 將已知濃度的初始菌量（6.4×109CFU/mL）通過10倍梯度稀釋，使菌液濃度分別為 6.4×109～6.4×101CFU/mL，分別污染到速凍肉糜類樣品中，模擬食物中的初始菌量分別為6.4×109～6.4×101CFU/g，分別提取其基因組DNA，進行LAMP擴增。將產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否產生梯形條帶，同時進行SYBR Green I顏色反應，探究增菌優化前LAMP方法的檢出限。

1.2.7 增菌優化后LAMP檢出限評價 將已知濃度的初始菌量（6.4×109CFU/mL）通過10倍梯度稀釋，使菌液濃度分別為 6.4×108～6.4×100CFU/mL，分別污染到速凍肉糜類樣品中，模擬食物中的初始菌量分別為 6.4×108～6.4×100CFU/g。再分別接種于增菌培養基中（依據國標，樣品與增菌培養基比例按1:9添加），均質后于37 °C增菌6 h，分別提取其基因組DNA，進行LAMP擴增。將產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否產生梯形條帶，同時進行SYBR Green I顏色反應，探究增菌優化后LAMP方法的檢出限。

1.2.8 人工污染速凍肉糜類盲樣檢測 從市場隨機采樣，購買速凍肉丸10份，速凍魚丸10份，速凍香腸制品10份，共計30份?！盎疱伭现破贰狈N類繁多，包括牛肉丸、香菇貢丸、包心魚丸、親親腸等，按產品主要原料及加工工藝將其主要分為三類，即速凍肉丸、速凍魚丸、速凍香腸制品。30份樣品經GB 4789.30-2016檢測，均不含單增李斯特菌，為了驗證本實驗建立的LAMP方法的準確度，人工污染10份樣品（污染濃度和數量分別為：6.4×101CFU/g 三份樣品，6.4×102CFU/g 三份樣品，6.4×103CFU/g四份樣品）后隨機混合制成盲樣，分別用傳統培養方法和LAMP方法重新檢測這30份樣品。

傳統培養方法按照 GB 4789.30-2016[15]進行操作。LAMP方法檢測按照無菌操作，取速凍肉糜類樣品25 g，放入無菌均質袋，加入225 mL Half-Fraser增菌液，在拍擊式均質器上連續均質2 min，于恒溫振蕩器中37 °C增菌6 h，用試劑盒提取DNA模板。LAMP反應體系按照1.2.4操作。

1.2.9 企業生產線樣本檢測 某食品企業提供生產線樣本30份，包括雞小胸原料、親親腸（速凍機入口處）、親親腸（速凍機出口處）、包心魚丸（速凍機入口處）、包心魚丸（速凍機出口處）。分別用傳統培養方法和LAMP方法進行檢測。

1.3 數據處理

實驗數據使用SPSS 17.0進行統計分析，結果以平均數±標準差表示。使用單因素方差分析（one way ANOVA）伴隨LSD多重比較，當P＜0.05時，認為組間具有顯著性差異。之后使用Origin Pro軟件繪制柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 增菌培養基的選擇

2.1.1 不同接種量的菌在Half Fraser中的增菌情況如圖1所示，單增李斯特菌的增菌效果與初始菌量有關系，初始菌量越大，生長速度越快。使用SPSS 17.0對實驗數據進行單因素方差分析（one way ANOVA）分析，當接種量為640 CFU/mL時，生長至4 h，其OD值為0.49，與初始菌量有顯著性差異（P＜0.05）；當接種量為 64 CFU/mL 時，生長至 4 h，其OD值為0.38，與初始菌量差異不顯著（P＞0.05），增菌至 6 h，其 OD 值為 0.58，差異顯著（P＜0.05）；當接種量為6.4 CFU/mL時，與64 CFU/mL增殖情況類似，生長至6 h，其OD值為0.45，此時與初始菌量有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 不同接種量的菌在Half Fraser中的增菌情況Fig.1 Bacteria increase with different inoculation amounts in Half Fraser

2.1.2 不同接種量的菌在Fraser中的增菌情況 如圖2所示，與 Half Fraser對比發現，當接種量為640 CFU/mL時，生長至6 h，其OD值為0.47，此時與初始菌量有顯著性差異（P＜0.05）；當接種量為64 CFU/mL時，增菌至6 h，其OD值為0.43，差異顯著（P＜0.05）；當接種量為 6.40 CFU/mL 時，需增菌至8 h，目標菌才會有顯著性的生長情況（P＜0.05），此時OD值為0.48，初步判定Half Fraser增菌效果更好。通過對比兩種增菌液培養基成分發現，Half Fraser和Fraser基本成分一致，后者的抑菌劑是前者的兩倍，高濃度的抑菌劑使目標菌生長速度變慢。

圖2 不同接種量的菌在Fraser中的增菌情況Fig.2 Bacteria increase with different inoculation amounts in Fraser

2.1.3 不同接種量的菌在LB1中的增菌情況 如圖3所示，當接種量小于等于640 CFU/mL時，其OD值與初始菌量均無顯著性差異（P＞0.05），這表明單增李斯特菌8 h內在LB1中增菌效果不佳，這可能與培養基中添加的抑菌劑有關，與Half Fraser和Fraser相比，LB1中添加的抑菌劑吖啶黃素和萘啶酮酸濃度較高，抑制雜菌效果好，但卻造成了單增李斯特菌生長速度較慢，如果要達到較好的增菌效果，可能需要更長的增菌時間。GB 4789.30-2016檢測中一般增菌（24±2） h，本實驗預篩選一種增菌速度快的增菌培養基（一個工作日即可完成檢測），因此LB1可能不適合作為本實驗的前增菌培養基。

圖3 不同接種量的菌在LB1中的增菌情況Fig.3 Bacteria increase with different inoculation amounts in LB1

2.1.4 不同接種量的菌在LB2中的增菌情況 如圖4所示，當接種量小于等于640 CFU/mL時，其OD值與初始菌量均無顯著性差異（P＞0.05），單增李斯特菌8 h內在LB2增菌液中生長受到了抑制。與LB1相比，LB2中添加的抑菌劑吖啶黃素和萘啶酮酸濃度不同，但與Half Fraser和Fraser相比，抑菌劑濃度仍然較高，這可能是造成8 h內Half Fraser肉湯對單增李斯特菌的增菌效果優于LB肉湯的主要原因，因此Half Fraser肉湯更適合作為本實驗的增菌培養基。

圖4 不同接種量的菌在LB2中的增菌情況Fig.4 Bacteria increase with different inoculation amounts in LB2

2.1.5 不同接種量的菌在四種培養基中的活菌數當菌液濃度低于6.4×104CFU/mL，使用細菌基因組提取試劑盒（TIANGEN）提取DNA，核酸提取濃度不能滿足LAMP檢測，因此需增菌至6.4×104CFU/mL以上。結果如表3、表4所示，單增李斯特菌在四種增菌液中的平板計數結果與OD600nm值結果趨勢一致。單增李斯特菌的增菌效果與初始菌量有關系，初始菌量越大，生長速度越快?？梢钥吹?，四種增菌培養基中，Half Fraser的增菌效果最好，當接種量為640 CFU/mL時，增菌 4 h，菌液濃度可達到 1.2×104CFU/mL；當接種量為64 CFU/mL時，增菌6 h，菌液濃度可達到 9.4×104CFU/mL；當接種量為6.4 CFU/mL時，8 h內菌液濃度與0 h無顯著性差異。綜上所述，選取Half Fraser為本實驗的增菌培養基，檢出限最低降至64 CFU/mL。

表3 接種量640 CFU/mL時單增李斯特菌在四種增菌液中生長差異性比較Table 3 Comparison of growth situation of Listeria monocytogenes in four kinds of culture medium at 640 CFU/ mL

表4 接種量64 CFU/mL時單增李斯特菌在四種增菌液中生長差異性比較Table 4 Comparison of growth situation of Listeria monocytogenes in four kinds of culture medium at 64 CFU/mL

2.2 增菌時間的確定

結果如圖5所示，至少增菌6 h才可滿足后續DNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳可檢測出梯形條帶，核酸熒光染料的染色結果呈陽性綠色。因此，確定該方法的最短增菌時間為6 h 。

圖5 增菌優化反應時間的確定Fig.5 Determination of reaction time for enrichment

2.3 增菌優化前LAMP方法的檢出限

結果如圖6所示，當菌液濃度為6.4×104CFU/mL時，LAMP反應后可檢測到梯形條帶，SYBR Green I染色結果為綠色，證明發生了特異性擴增，檢測結果呈陽性；而當菌液濃度為6.4×103CFU/mL時，LAMP 擴增后未檢測到梯形條帶，SYBR Green I染色結果為橙色，檢測結果呈陰性，因此，增菌優化前，LAMP檢測人工污染速凍肉糜類制品單增李斯特菌的檢出限為6.4×104CFU/g。

圖6 增菌優化前LAMP方法檢出限Fig.6 Detection limit of LAMP befor enrichment

2.4 增菌優化后LAMP方法的檢出限

結果如圖7所示，當菌液濃度為6.4×101CFU/mL時，通過6 h的前增菌，LAMP反應后可檢測到梯形條帶，SYBR Green I染色結果為綠色，表明發生了特異性擴增，即結果呈陽性。當菌液濃度為6.4 CFU/mL時，電泳未檢測到梯形條帶，SYBR Green I染色結果為橙色，即結果呈陰性，表明此菌液濃度下，沒有發生LAMP擴增。因此，通過6 h的前增菌，本實驗檢測人工污染速凍肉糜類制品單增李斯特菌的檢出限為6.4×101CFU/g，比增菌前降低了三個數量級。

圖7 增菌優化后LAMP方法檢出限Fig.7 Detection limit of LAMP after enrichment

2.5 人工污染速凍肉糜類盲樣檢測結果

檢測結果如表5所示。國標的檢測結果中有10份陽性樣品，20份陰性樣品。以國標為標準，LAMP 方法檢測結果與其一致，無假陽性，無漏檢情況，準確度為100%。

表5 人工污染樣品檢測結果統計Table 5 Detection results of artificially contaminated samples

2.6 企業生產線樣本檢測結果

檢測結果如表6所示。25份樣品同時用國標法和LAMP方法檢測，兩種方法的檢測結果相一致。企業生產線質量監管較為嚴格，此次采集樣本檢測結果均為陰性。據文獻報道，速凍肉糜類制品在加工過程中交叉污染可能更為常見[31-32]。

表6 生產線樣本單增李斯特菌檢出情況Table 6 Listeria monocytogenes detection in production line samples

3 結論

本研究比較了四種增菌培養基對單增李斯特菌的增菌效果。以OD600nm和平板計數活菌數為指標，結果顯示Half Fraser的增菌效果最好，從6.4×101CFU/mL增菌至9.4×104CFU/mL，用時6 h。增菌優化后，LAMP檢測速凍肉糜類制品中單增李斯特菌的檢出限為 6.4×101CFU/g，比增菌前降低了三個數量級。將LAMP方法應用于人工污染速凍肉糜類盲樣樣品和企業生產線樣本檢測，同時與國標法對比，本方法與國標法檢測結果一致。

本研究基于LAMP方法，結合6 h的前增菌，可將檢測時間縮短至8 h，無需專業設備，根據顏色的變化即可判斷檢測結果，直觀簡便，適合基層對食品中單增李斯特菌的現場快速檢測。目前由于技術本身的限制，LAMP方法的檢出限略高于實時熒光定量PCR技術，為了更好的檢測樣品中可能存在的少量細菌，在實際樣品處理時，可以延長增菌時間以降低 LAMP 方法的檢出限?？傊?，LAMP技術將有望成為食源性致病菌檢測的有效方法，為產品檢測及安全追溯提供依據。