基于動態散斑照明的寬場熒光顯微技術理論研究*

尹君 王少飛 張俊杰 謝佳諶 陳宏宇賈源 胡徐錦 于凌堯2)

1) (桂林電子科技大學電子工程與自動化學院,光子學中心,桂林 541004)

2) (桂林電子科技大學,廣西自動檢測技術與儀器重點實驗室,桂林 541004)

為獲取生物組織和活體細胞內部精細結構,要求顯微成像技術具備層析成像能力.基于動態散斑照明的寬場熒光顯微技術利用動態變化的散斑圖案全場照明待測樣品,通過提取焦平面內變化劇烈的熒光信號,獲得三維結構的熒光層析圖像.本文通過理論分析和模擬仿真,研究了這一熒光顯微技術獲取熒光層析圖像的過程.模擬仿真了影響熒光層析圖像成像質量的主要因素,CCD 記錄的原始熒光圖像數量和散射體顆粒度與成像質量的關系.模擬仿真結果表明,熒光層析圖像的成像質量隨原始熒光圖像數量的增加先提高后趨向飽和,隨散射體顆粒度的增大先增大后降低.綜合考慮成像質量和成像時間等因素,當用于提取熒光層析圖像的原始熒光圖像的數量為60 幅,散射體顆粒度為1000 左右時,可獲得圖像對比度高于85%的高空間分辨率熒光層析圖像.理論分析和模擬仿真研究工作為基于動態散斑照明的寬場熒光顯微技術的系統結構設計、實現和優化提供了理論基礎和指導.

1 引言

近年來,隨著激光、熒光標記、微弱信號探測、圖像處理和計算機等技術的飛速發展,激光掃描共焦熒光顯微技術(laser scanning confocal fluorescence microscopy,LSCM)已成為快速獲取生物組織和活體細胞內部精細結構和功能信息的重要研究工具,從根本上改變了觀察、記錄、解釋和理解生命體生命活動過程的方式[1-4].LSCM 基于生物樣品自體熒光或通過熒光標記提供高的化學特異性和成像對比度,采用聚焦激光光束逐點掃描的方式激發待測樣品中的熒光團產生熒光信號.通過安裝在光電探測器共軛位置處的共焦光闌有效消除離焦熒光信號的影響,從而實現具有高空間分辨率的三維層析成像[5,6].然而,LSCM 系統采用逐點掃描的成像方式,導致成像時間長,激發效率低,結構復雜,造價昂貴.此外,光毒性、光損傷和光致漂白等也是其無法回避的問題[7-9].因此,開發一種能夠在較長觀察時間內快速獲取生物樣品,具有高時空分辨率三維結構層析圖像的顯微成像方法一直是研究的熱點.

基于動態變化的激光散斑寬場照明實現的動態散斑照明熒光顯微技術(dynamic speckle illumination fluorescence microscopy,DSIFM)是一種在寬場照明條件下,快速獲取具有高時空分辨率的生物組織和活體細胞三維結構熒光層析圖像的有效方法[10-13].在使用DSIFM 獲取熒光層析圖像的過程中,散斑顆粒度和重構層析圖像所需采集的原始圖像數量是影響圖像質量和成像時間的關鍵因素.本論文基于DSIFM 的成像原理,理論分析了基于動態變化的散斑寬場照明,獲取待測生物樣品高空間分辨率熒光層析圖像的過程.在此基礎上,模擬仿真了在DSIFM 技術中不同顆粒度和原始熒光圖像數量兩個主要的技術參數,對獲取不同尺寸待測樣品的熒光層析圖像的成像質量,包括圖像對比度和空間分辨率的影響.模擬仿真結果對于有效提高系統成像質量,縮短成像時間具有重要的參考價值和指導意義.

2 理論基礎

當激光光束通過具有一定顆粒度的散射體時,由于散射體中散射顆粒的隨機分布,產生的散射光會在自由空間中相互干涉疊加,形成強度隨機分布的干涉圖案,即“散斑圖案”.在DSIFM 系統中,激光光束通過散射體后形成的散斑圖案經光學系統在顯微物鏡后焦平面上形成清晰的像,通過顯微物鏡在待測樣品中形成寬場科勒照明.照明散斑圖案激發樣品中的熒光團產生熒光信號,經帶通濾光片濾除激發光和雜散光等背景噪聲,由CCD 相機探測接收.這些熒光信號主要有兩個來源,包括產生自顯微物鏡焦平面上的熒光信號和產生自視場范圍內焦平面以外的背景熒光.理論上可以將CCD相機接收到的熒光信號表示為[11]

式中,C(ρ,z)為樣品中熒光團濃度,Is(ρ,z) 為照明散斑圖案激發樣品產生的熒光信號強度,PSFdet為探測點擴展函數,ρ為散斑場半徑,ρd為CCD相機的探測面半徑.

通過改變激光光束通過散射體的位置,即可在顯微物鏡視場范圍內形成一系列光強分布隨機變化的照明散斑圖案.隨著照明散斑圖案的不斷變化,在樣品中焦平面上激發產生的熒光信號相比于焦平面以外的離焦熒光信號變化更為劇烈.在樣品中縱向位置zc處,CCD 相機的每個像素接收到的熒光信號強度變化可以表示為[14]

式中,角括號表示對相互獨立的照明散斑圖案激發產生的熒光信號強度取平均值.

為求解(2)式表示的熒光信號強度變化量,在此引入自相關函數定義為

式中,Δρ=|ρ-ρ′|.則CCD 探測器上接收的熒光信號的變化可以表示為

式中,PSFill為照明點擴展函數.均方根(root mean square,RMS)圖像強度可以由得到,其與樣品中的熒光團濃度具有線性關系.

在實際應用中,為了實現在動態變化的照明散斑圖案全場照明的條件下,消除離焦熒光信號的干擾,獲取具有高空間分辨的焦平面的熒光層析圖像,需要CCD 相機采集對應于不同照明散斑圖案激發產生的一系列原始熒光圖像.隨后,利用層析圖像提取算法,對原始熒光圖像進行處理,從而重構均方根圖像IRMS,實現層析成像.經常采用的熒光層析圖像提取算法如(5)式所示:

式中,N為需采集的原始熒光圖像數量;Ii為在動態散斑照明條件下,CCD 相機記錄的第i幅原始熒光圖像強度.因此,照明散斑圖案的強度分布,即散射體的顆粒度G,和所需記錄的原始熒光圖像的數量N是影響熒光層析圖像成像質量的重要因素.

3 模擬仿真結果分析

為深入研究散射體顆粒度G和需記錄的原始熒光圖像數量N對具有不同幾何尺寸的待測樣品的層析圖像成像質量的影響,模擬仿真過程中首先設計了半徑分別為R和10R的兩個小球作為待測樣品.模擬生成的具有不同半徑的小球樣品的焦平面熒光圖像和疊加了離焦信號的離焦熒光圖像如圖1所示.

圖1 不同半徑的兩個小球樣品的焦平面熒光圖像 R (a),10R (b)和離焦熒光圖像 R (c),10R (d)Fig.1.Fluorescence images of focal (a),(b) and defocus (c),(d) planes of two small spherical samples with radii of R and 10R respectively.

當激光光束通過具有不同顆粒度的散射體時,形成的一系列強度分布不同的照明散斑圖案模擬結果如圖2所示.

圖2 激光光束通過顆粒度分別為100 (a),1000 (b)和3000 (c)的散射體形成的照明散斑圖案Fig.2.Illumination speckle patterns are formed when a laser beam passes through diffusers with different granularity of 100 (a),1000 (b) and 3000 (c),respectively.

將模擬仿真生成的不同散斑強度分布的N幅照明散斑圖案與具有不同半徑的小球樣品的離焦圖像疊加,獲得照明散斑圖案激發小球樣品的離焦熒光圖像.隨后,利用層析圖像提取算法處理離焦熒光圖像,獲得消除離焦背景噪聲干擾的熒光層析圖像.利用上述基于動態散斑照明的寬場熒光顯微成像技術實現熒光層析成像方法,分析了當顆粒度為固定值時,對于不同半徑的小球樣品,熒光層析圖像的對比度和空間分辨率與原始熒光圖像的數量之間的關系.對于半徑為R的小球樣品,當散射體顆粒度固定為G=1000 時,原始熒光圖像的數量N分別為20,60和200 時,層析圖像的模擬仿真結果如圖3(a)—(c)所示.圖3(d)—(f)分別為半徑為R的小球樣品的重構層析圖像中心位置處熒光信號歸一化強度曲線.其中,實線為焦平面上小球樣品的熒光信號的歸一化強度,虛線為利用層析圖像處理算法處理包含離焦信號的小球樣品離焦熒光圖像得到的層析圖像的熒光信號歸一化強度,即圖像對比度.層析圖像的熒光信號歸一化強度平均值分別為63.14%,86.42%和86.21%,先提高后趨于飽和.用信號歸一化強度曲線的半高全寬(full width at half maximum,FWHM)表示圖像的空間分辨率.由仿真結果可以看出,重構得到的小球樣品的熒光層析圖像的空間分辨率與焦平面圖像的基本一致.

圖3 顆粒度為1000 時,半徑為R 的小球樣品熒光層析圖像 (a)—(c)及中心位置處熒光信號歸一化強度(d)—(f) (a),(d) N=20;(b),(e) N=60;(c),(f) N=200Fig.3.The fluorescence sectioning images (a)—(c) of a small spherical sample with a radius of R and the normalized intensity (d)—(f)of the fluorescence signal at the center position with the granularity of diffuser being 1000:(a),(d) N=20;(b),(e) N=60;(c),(f)N=200.

對于半徑為10R的小球樣品而言,當顆粒度固定為G=500 時,原始熒光圖像的數量N分別為20,60和200 時,層析成像的模擬仿真結果如圖4(a)—(c)所示.圖4(d)—(f)分別為半徑為10R的小球樣品層析重構圖像中心位置處信號歸一化強度曲線.其中,實線為焦平面上小球樣品的熒光信號的歸一化強度,虛線為利用層析圖像處理算法處理包含離焦信號的小球樣品離焦熒光圖像得到的層析圖像的熒光信號歸一化強度.層析圖像的熒光信號歸一化強度平均值分別為50.5%,81.71%和83.02%,先提高后趨于飽和.小球樣品的熒光層析圖像的空間分辨率與焦平面圖像的基本一致.

圖4 顆粒度為500 時,半徑為10R 的小球樣品熒光層析圖像 (a)—(c)及中心位置處熒光信號歸一化強度(d)—(f) (a),(d) N=20;(b),(e) N=60;(c),(f) N=200Fig.4.The fluorescence sectioning images (a)—(c) of a small spherical sample with a radius of 10R and the normalized intensity(d)—(f) of the fluorescence signal at the center position with the granularity of diffuser being 500:(a),(d) N=20;(b),(e) N=60;(c),(f) N=200.

為獲得不同顆粒度條件下,熒光層析圖像的圖像質量與原始熒光圖像數量之間的關系.利用上述層析圖像提取算法進一步分析了在不同散射體的顆粒度G=20,100,500,1000,1500,2000,3000,3500 條件下,不同直徑的小球樣品的層析圖像的熒光信號歸一化強度平均值與CCD 相機記錄小球樣品的原始熒光圖像數量之間的關系,如圖5所示.

由圖5可知,對于不同直徑的小球樣品而言,當散射體的顆粒度一定時,熒光層析圖像的對比度隨著CCD 相機記錄的原始熒光圖像數量的增加而增大,并逐漸趨于飽和.根據模擬仿真結果分析可知,在動態散斑照明條件下,散斑照明區域隨機分布,激發產生的熒光信號也是隨機產生的.當散射體的顆粒度一定時,采集的原始熒光圖像數量過少,利用算法提取得到的圖像信息有所丟失,導致獲得的熒光層析圖像的圖像質量較差.當采集的原始熒光圖像達到一定數量后,即可較完整地恢復焦平面上待測樣品的熒光圖像,從而獲得高質量的熒光層析圖像.隨著原始熒光圖像數量的進一步增加,對圖像質量的提升沒有影響,反而會降低系統的成像速度.

圖5 不同顆粒度條件下,層析圖像熒光信號歸一化強度平均值與原始熒光圖像數量之間的關系(a)小球樣品;(b)大球樣品Fig.5.When the granularities of diffusers are different,the relationships between the average values of the normalized intensity of the fluorescence signals of sectioning images and the numbers of the original fluorescence images:(a) Small ball;(b) large ball.

此外,利用這一方法分析了對于不同半徑的小球樣品,當CCD 記錄的原始熒光圖像數量為固定值時,熒光層析圖像的對比度和空間分辨率與散射體顆粒度之間的關系.對于半徑為R的小球樣品而言,當原始熒光圖像的數量N固定為120,顆粒度G分別為100,1000和3000 時,層析成像的模擬仿真結果如圖6(a)—(c)所示.層析圖像的熒光信號歸一化強度平均值分別為80.03%,97.22%和76.81%,先增加后減小,如圖6(d)—(f)所示.小球樣品的熒光層析圖像的空間分辨率與焦平面圖像的基本一致.

圖6 CCD 記錄120 幅原始熒光圖像時,半徑為R 的小球樣品熒光層析圖像 (a)—(c)及中心位置處熒光信號歸一化強度(d)—(f) (a),(d) G=100;(b),(e) G=1000;(c),(f) G=3000Fig.6.The fluorescence sectioning images (a)—(c) of a small spherical sample with a radius of R and the normalized intensity (d)—(f)of the fluorescence signal at the center position with 120 original fluorescence images being recorded by CCD:(a),(d) G=100;(b),(e) G=1000;(c),(f) G=3000.

對于半徑為10R的小球樣品而言,當原始熒光圖像的數量N固定為120,顆粒度G分別為20,1000和3000 時,層析成像的模擬仿真結果如圖7(a)—(c)所示.層析圖像的熒光信號歸一化強度平均值分別為63.27%,83.28%和73.04%,如圖7(d)—(f)所示,也是呈現先增大后減小的趨勢.小球樣品的熒光層析圖像的空間分辨率與焦平面圖像的基本一致.

由仿真結果還可以看出,當G=20 時,由于散射體顆粒度較小,單位面積內照明的散斑面積較大.照明散斑圖案強度分布變化的過程中,較大體積的均勻待測樣品的中心部分熒光信號強度的變化不大,而邊緣部分的則變化較大.因此,熒光層析圖像中心位置的對比度低于邊緣部分,如圖7(d)所示.仿真結果說明,利用小顆粒度的散射體可獲取包含均勻介質的大體積樣品邊界輪廓的熒光層析圖像.

圖7 CCD 記錄120 幅原始熒光圖像時,半徑為10R 的小球樣品熒光層析圖像 (a)—(c)及中心位置處熒光信號歸一化強度(d)—(f) (a),(d) G=20;(b),(e) G=1000;(c),(f) G=3000Fig.7.When 120 original fluorescence images are recorded by CCD and the different granularity of diffuser,G=20,1000,3000,The fluorescence sectioning images (a)—(c) of a small spherical sample with a radius of 10R and the normalized intensity (d)—(f) of the fluorescence signal at the center position with 120 original fluorescence images being recorded by CCD:(a),(d) G=20;(b),(e) G=1000;(c),(f) G=3000.

為了獲得不同原始熒光圖像數量條件下,熒光層析圖像的圖像質量與散射體顆粒度之間的關系.利用上述層析圖像提取算法分析了在CCD 相機記錄小球樣品的不同原始熒光圖像數量N=20,40,60,80,100,120,160,200 條件下,不同直徑的小球樣品的層析圖像歸一化強度平均值與散射體顆粒度G之間的關系,如圖8所示.

圖8 CCD 記錄不同原始熒光圖像數量時,層析圖像熒光信號歸一化強度平均值與散斑顆粒度之間的關系(a)小球樣品;(b)大球樣品Fig.8.The relationships between the average values of the normalized intensity of the fluorescence signals of sectioning images and the diffuser granularities with different numbers of the original fluorescence images being recorded by CCD:(a) Small ball;(b) large ball.

由圖8可知,基于動態散斑照明的條件下,當CCD 相機記錄的原始熒光圖像數量較少時(N=20),有較多的熒光信號未被記錄,利用層析圖像提取算法得到的不同直徑的小球樣品焦平面層析圖像對比度較低.當CCD 相機記錄一定數量的原始熒光圖像,N≥ 60 時,隨著散射體顆粒度的增大,小球樣品的焦平面層析圖像對比度先增加后下降.根據模擬仿真結果分析可知,在動態散斑照明條件下,散斑照明區域隨機分布,激發產生的熒光信號也是隨機產生的.當采集的原始熒光圖像數量一定時,散射體的顆粒度較小,激發產生熒光信號的散斑照明區域較大.而當散射體的顆粒度較大時,激發產生熒光信號的散斑照明區域密度較大.因此,在上述兩種情況下,照明區域內隨機激發產生的熒光信號變化不劇烈,無法分離離焦熒光信號實現熒光層析成像.

4 結論

基于動態散斑照明的寬場熒光顯微成像方法利用動態變化的散斑圖案全場照明待測生物組織或細胞樣品,通過層析圖像提取算法獲取待測樣品高時間和空間分辨率的三維結構層析圖像,具有結構簡單、造價低廉和操作容易等特點,在生物學、醫學和生命科學等研究領域中具有廣闊的應用前景.本論文通過模擬仿真方法,研究分析了這種熒光層析成像方法中影響圖像質量的主要因素,即散斑顆粒度和CCD 記錄的原始熒光圖像數量.在動態散斑照明條件下,散斑照明區域隨機分布,激發產生的熒光信號也是隨機產生的.模擬仿真結果表明,熒光層析圖像的圖像質量隨原始熒光圖像數量的增加先提高后趨向飽和.原始熒光圖像數量過少,導致信息丟失,獲得的層析圖像質量差;而數量過多,又會降低成像速度.此外,熒光層析圖像的質量隨散射體顆粒度的增加先增加后減少.顆粒度過低或過高時,系統均不具備層析成像能力.綜合考慮圖像質量和成像時間等因素,當用于提取層析圖像的原始熒光圖像數量為60 幅,散射體顆粒度為1000 左右時,可獲得圖像對比度高于85%的高空間分辨率熒光層析圖像.上述理論分析和模擬仿真研究工作為實現基于動態散斑照明的寬場熒光層析成像方法提供了理論基礎和指導,對基于該方法的系統結構設計、實現和進一步優化,以及利用該方法獲取生物組織或細胞的高分辨率三維結構圖像,從而深入研究和解決生命科學問題具有重要意義.