基于聚（N-異丙基丙烯酰胺）的溫度響應型可注射水凝膠的制備及其性能研究

＊潘穗萍 陶倩 王怡婷

（魯東大學化學與材料科學學院 山東 264025）

水凝膠通常是柔軟的固體材料，具有三維網狀結構，其網絡中的孔隙使得水凝膠能夠保存大量的溶液，有利于傳遞和運輸生物分子、營養物質以及細胞生理活動過程中的代謝廢物。然而預制成型的水凝膠在組織工程應用中會遇到很多問題，如手術過程復雜、創傷面積較大、凝膠形狀不能與缺損處完全吻合等?？勺⑸淠z可以有效避免這些問題，因為它在進入人體之前處于低粘度的流體狀態，進入人體之后通過某種物理或化學變化快速原位轉變為非流動的凝膠狀態[1-2]。目前已經報道了多種基于不同機理的可注射凝膠[3-4]，其中利用手術環境和人體的溫度差異設計出來的溫度響應型水凝膠因其組分簡單、安全低毒、操作簡便等優勢而備受矚目[5-6]。

溫度響應型材料的研究和發展比較廣泛，其中的典型代表是聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm），它的最低臨界溫度（LCST）接近且略低于人體體溫，在37℃環境中能夠快速發生相轉變[7]。然而僅依靠PNIPAAm并不能構成三維網狀結構，同時其力學性能和其它功能也難以調控和擴展。因而本文采用天然聚合物殼聚糖（CS）作為可注射水凝膠的結構主體[8]，通過自由基聚合的方法在殼聚糖分子上引入PNIPAAm鏈段，以期能夠制備出具有良好力學性能和藥物傳遞功能的溫度響應型可注射水凝膠。

1.實驗部分

(1)試劑與儀器

殼聚糖（CS，脫乙酰度≥95%）購于上海阿拉丁試劑有限公司；N-異丙基丙烯酰胺（NIPAAm，98%）購于上海麥克林生物有限公司；四甲基乙二胺（TEMED，≥99.5%）購于上海阿拉丁試劑有限公司；過硫酸銨（APS，分析純）購于國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸阿霉素（DOX，98%）購于上海麥克林生物有限公司。

核磁共振波譜儀（AVANCE NEO，瑞士布魯克）用于測試產物結構；旋轉流變儀（DHR-2，美國TA）用于測試樣品的多種流變性能；紫外可見分光光度計（T6新世紀，北京普析通用）用于測試載藥釋藥實驗中的藥物濃度。

(2)殼聚糖/聚(N-異丙基丙烯酰胺)(CS/PNIPAAm)的制備

準確稱取殼聚糖和NIPAAm（兩者的質量和為0.5g，每組實驗設計為不同的配比），共同溶于10mL 1%的乙酸溶液中。伴隨著電磁攪拌，依次滴加NIPAAm質量0.45倍的TEMED和0.3倍的APS，分別作為催化劑和引發劑。將反應體系密封后在25℃繼續反應24h。將反應產物移入透析袋中，用去離子水透析三天以純化，之后冷凍干燥得到固體樣品。稱取少量樣品溶于氘代水后用于核磁共振測試。

(3)溫度響應性能測試

配制濃度為5%的CS/PNIPAAm水溶液，靜置24h以達到完全溶解狀態。然后放入37℃的恒溫水浴中，觀察其在室溫和37℃時的狀態變化。

(4)流變性能測試

使用旋轉流變儀對上述濃度為5%的CS/PNIPAAm水溶液進行多項測試。固定溫度為37℃，應變為1%，在頻率0.1～100rad/s范圍內進行了頻率掃描；固定溫度為37℃，頻率為1rad/s，在應變0.1%～10000%范圍內進行了應變掃描。

(5)載藥和釋藥實驗

載藥：取0.5g CS/PNIPAAm，按照投藥比m（DOX）:m（CS/PNIPAAm）=1%、2%和3%分別加入DOX與1mL磷酸緩沖溶液（PBS，pH=7.5），充分溶解后將所得樣品標注為DOX@CS/PNIPAAm。

釋藥：將多組DOX@CS/PNIPAAm樣品放入37℃的恒溫搖床中，待轉變為凝膠狀態后，加入8mL PBS緩沖溶液。分別在1h、2h、3h、4h、8h、12h、24h和36h后取樣并測試釋放到PBS中的DOX濃度。每次取樣3mL，并同時補充等量的新鮮PBS緩沖溶液。DOX濃度是利用紫外可見分光光度計在495nm處根據標準曲線確定。

2.結果與討論

(1)CS/PNIPAAm的結構鑒定與溫度響應性能

CS/PNIPAAm的合成是通過自由基聚合實現的。在這個過程中，不僅是NIPAAm單體自身發生聚合反應，同時也會與殼聚糖上的氨基鍵合在一起，形成殼聚糖分子的主鏈接枝PNIPAAm鏈段的結構[9]。在CS/PNIPAAm的1H核磁共振譜中可以找到殼聚糖羥基的吸收峰（δ=3.90ppm）和PNIPAAm上異丙基的吸收峰位置（δ=1.15ppm），這表明殼聚糖與NIPAAm的聚合反應是成功的（圖1）。

圖1 CS/PNIPAAm的1H核磁共振譜

CS/PNIPAAm的溫度響應性能可以直接觀察到，溶解后的CS/PNIPAAm室溫時是透明可流動的溶液狀態（圖2左），當置于37℃水浴中后很快就形成了不透明不能流動的凝膠狀態（圖2右）。而且這個轉變是可逆的，當樣品在室溫中冷卻一段時間后又可以恢復到透明可流動的溶液狀態。這是因為PNIPAAm分子鏈中含有疏水的異丙基和親水的酰胺基，當溫度低于其LCST時，由于酰胺基和水形成氫鍵，PNIPAAm鏈段在水中的溶解度高，分子鏈呈現伸展或者水合線圈構象；當溫度高于LCST時，氫鍵被破壞，PNIPAAm鏈段收縮團聚。接枝在不同殼聚糖分子上的PNIPAAm彼此聚集，起到了物理交聯CS/PNIPAAm分子的作用，因而形成了具有三維網狀結構的凝膠。

圖2 CS/PNIPAAm的溶液-凝膠可逆轉變（左圖：室溫，右圖：37℃）

(2)CS/PNIPAAm的流變性能

從頻率掃描測試的結果中可以看出，在整個頻率范圍內儲能模量（G’）大于損耗模量(G”)，這表明37℃時CS/PNIPAAm始終能保持住它的交聯結構（圖3）。隨著頻率的增加，G’和G”都在增加，這是因為CS/PNIPAAm的交聯作用并非是分子間的共價鍵構成，而是一種物理交聯作用。比較兩圖可知，NIPAAm含量較多的水凝膠體系的G’和G”均較大，意味著更高的力學強度，這是因為NIPAAm組分的增加為水凝膠結構帶來了更大的交聯密度。此外還可以觀察到體系的復合黏度η隨著頻率的增大而逐漸減小，這里的頻率和剪切速率正相關，因此這種黏度變化驗證了CS/PNIPAAm水凝膠具有剪切變稀的性質，這是設計可注射水凝膠的重要特點[10]。

圖3 兩種CS/PNIPAAm水凝膠的頻率掃描測試，CS和NIPAAm的質量比分別為1:6（a）和1:9（b）

應變掃描測試的曲線分為明顯的兩個部分（圖4）。當應變較小時，G’維持在一個較為穩定的值并且始終大于G”，這說明在此范圍內三維網狀結構得以穩定保持。隨著應變的繼續增大，G’和G”均下降，但G’的下降速度更快，最終小于G”，說明此時水凝膠的三維網狀結構已經遭到了破壞。同時發現，NIPAAm含量較多的水凝膠體系的屈服應變更大，表明了其具有更高的結構強度。結合上文所述頻率掃描的測試結果，可以考慮通過改變NIPPAm含量來調控可注射水凝膠的力學性能。

圖4 兩種CS/PNIPAAm水凝膠的應變掃描測試，CS和NIPAAm的質量比分別為1:6（a）和1:9（b）

(3)CS/PNIPAAm的釋藥行為

六組釋藥實驗完成后，統計每次取樣時的累計藥物釋放量，并繪制出其隨時間變化的曲線，如圖5所示?？梢钥闯鏊胸撦d了DOX的CS/PNIPAAm水凝膠初期釋放速度較快，隨后發生不同程度的減速，最終20h后趨于穩定，具有一定的緩釋效果?？傮w來看，累計釋放量隨投藥比的增大而增大，且大部分樣品最大釋放量可達75%～90%。此外，NIPAAm含量較多的樣品其累積釋放量大于NIPAAm含量較少的，這可能是因為更多的NIPAAm造成了37℃時更高的交聯密度，CS/PNIPAAm分子間的聚集和塌縮更嚴重，所以藥物小分子更容易從凝膠孔隙中被擠出，導致了更快的釋藥速度和更大的累計釋放量。

圖5 DOX@CS/PNIPAAm的累計藥物釋放曲線（CS和NIPAAm的質量比為1:6或1:9，投藥比為1%或2%或3%）

3.結論

本文通過自由基聚合成功制備了CS/PNIPAAm共聚物，將其溶解后可實現溫度響應可逆的溶液-凝膠轉變，這一特性賦予了它作為可注射凝膠的重要應用前景。流變測試結果表明這種可注射水凝膠具有良好的力學性能，并且可以根據不同的應用場景，通過改變原料組分中NIPPAm的含量來調控其力學性能。同時，CS/PNIPAAm水凝膠可以方便地負載藥物并對其進行緩慢釋放。此類水凝膠有望在組織工程、體內支架、藥物傳遞等領域得以應用。