半滑舌鰨CsNLR-C6和CsNLR-C7基因的克隆及免疫應答分析

陳張帆，王 潔，徐錫文，周 茜，陳松林

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島海洋科學與技術試點國家實驗室，海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東青島 266071；2.山東省海洋漁業生物技術與遺傳育種重點實驗室，山東青島 266071；3.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

先天免疫系統是生物體以非特異方式抵御病原體（包括細菌和病毒）入侵的首道屏障。作為先天免疫系統的重要組成部分，模式識別受體（pathogen／pattern recognition receptors，PRRs）通過識別病原相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），觸發免疫反應（如炎癥反 應）［1］。NOD樣受體家族（NOD-like receptors，NLRs）是一類識別胞內PAMPs的PRR，在機體的抗細菌和抗病毒的免疫應答中起著重要的調控作用［2］。目前，在人類基因組中已鑒定出22個NLR蛋白，這些蛋白都具有NLR家族保守的結構域：N末端的效應器結構域，通常包含熱蛋白結構域（PYR）、半胱天冬氨酸募集結構域（CARD）等；C末端的亮氨酸重復序列（LRR），主要含有配體結合位點；中段最保守的核苷酸結合寡聚化結構域（NACHT），用于自身低聚反應和自我調控［3-4］。

根據功能域的不同，魚類的NLRs主要分為3個亞家族：NLR-A（與哺乳動物的NODs同源）、NLR-B（與哺乳動物的NALPs同源）、NLR-C（魚類特有）［3］。魚類中的NLR-C亞家族除了具有NLR家族保守的NACHT和LRR結構域外，還具有N末端魚類特有的FISNA（fish-specific NACHT associated）結構域，和／或具有C末端的B30.2結構域。B30.2結構域包含絲氨酸-脯氨酸-精氨酸-酪氨酸模體（SPRY）和脯氨酸-精氨酸-酪氨酸模體（PRY），已被證實參與調控哺乳動物的免疫反應［5］。目前，已在斑馬魚（Danio rerio）［3］、斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［6］、牙 鲆（Paralichthysolivaceus）［7］、鮸（Miichthys miiuy）［8］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［9］中報道了NLR-C亞家族基因的克隆，并發現NLR-C基因表達量受LPS和poly I∶C刺激后升高，參與調控魚體的先天免疫反應。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）是我國重要的海水經濟養殖魚類之一，因其營養價值高、生長速率快、活動范圍小等特點，深受消費者歡迎，養殖前景廣闊［10］。然而，隨著養殖規模的擴大，病害頻發，半滑舌鰨養殖業的健康發展受到嚴重制約。其中，哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）是引起半滑舌鰨細菌性疾病的主要病原菌之一，發病癥狀主要表現為體表皮膚潰爛、爛尾、爛鰭等［11］。為了探究半滑舌鰨抗哈維氏弧菌病的分子機制，研究人員對免疫相關基因進行了研究，如Toll樣受體［12］、趨化因子［13］、多聚免疫球蛋白受體［14］、腫瘤壞死因子受體相關因子［15］等。前期研究中，通過生物信息學分析鑒定分析了半滑舌鰨NLR基因家族29個成員，其中，CsNOD3和CsNOD4基因對哈維氏弧菌感染表現出快速應答模式［16］，CsCIITA參與了半滑舌鰨抗哈維氏弧菌的免疫反應，并直接調控MHC IIA和MHC IIB基因的表達［17］。本研究通過克隆分析半滑舌鰨的CsNLRC6和CsNLR-C7基因，檢測其在健康組織中的分布模式，以及其在不同感染組織中對哈維氏弧菌的響應模式，以期為探討NLR基因家族在半滑舌鰨、乃至硬骨魚類的先天免疫系統中的重要作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

4尾健康半滑舌鰨［平均體質量（31.0±6.5）g；平均體長（17.1±1.0）cm］購自山東海陽市黃海水產有限公司，解剖收集鰓、心臟、頭腎、腸、腎臟、肝臟、肌肉、皮膚、脾臟、胃等組織樣品，置于-80℃凍存，用于總RNA的提取。

哈維氏弧菌感染實驗參考WEI等［18］的實驗方法，即另取相同來源60尾10月齡生長狀態良好的半滑舌鰨，經腹腔注射1.0×104cfu哈維氏弧菌。以感染前0 h作為對照，在注射12、24、48、72、96 h后，分別在各個時間點隨機取樣5尾魚，解剖收集腎臟、鰓、腸、脾臟和肝臟組織，置于-80℃凍存，用于總RNA的提取。

1.2 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

采用TRIzol試劑（Invitrogen，美國）提取總RNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用超微量分光光度計P100（Pultton，美國）檢測RNA的濃度和質量。采用PrimerScriptTM RT reagent kit（TaKaRa，中國大連）進行痕量基因組DNA的去除以及cDNA第一鏈的合成。

1.3 獲得CsNLR-C6和CsNLR-C7基因核心片段序列

基于InterProScan［19］對半滑舌鰨基因組［10］進行蛋白功能域的預測結果，以NLR基因家族保守的NACHT結構域和魚類NLR-C家族特有的FISNA結構域進行搜索，篩選出16個半滑舌鰨NLR-C基因［16］，其中根據CsNLR-C6和CsNLR-C7的cDNA序列，設計擴增其開放閱讀框（ORF）序列的特異性引物（表1），采用PCR技術擴增目的條帶，PCR反應體系為25μL，反應程序為：95℃，3 min；95℃，30 s，58℃，30 s，72℃，2 min，35個循環；72℃，10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化并克隆到pEASY-T1載體上，轉化至大腸桿菌DH5α中，挑取陽性克隆送至北京擎科新業生物技術有限公司（青島）進行測序驗證。

1.4 CsNLR-C6和CsNLR-C7基因序列分析

利用DNAMAN軟件包對克隆得到的CsNLRC6和CsNLR-C7的核酸和氨基酸進行序列比對。通過ExPaSy ProtParam工具（http：／／web.expasy.org／protparam）對其分子量（Mw）和等電點（pI）進行預測。利用SMART預測CsNLR-C6和CsNLRC7的蛋白結構域，與CsNOD1-5蛋白序列的結構域進行比對分析。從NCBI上搜索人類（Homo sapiens）、斑馬魚、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、半滑舌 鰨NOD1、NOD2、NOD3（NLRC3）、NOD4（NLRC5）、NOD5（NLRX1）及同源序列（表2），利用在線服務器GUIDANCE2 Server（http：／／guidance.tau.ac.il／）［20］，選 擇MAFFT算法（默認參數值）［21］進行多重氨基酸序列比對，使用IQ-TREE軟件構建系統進化樹（-B1000-alrt 1000）［22］。

1.5 實時熒光定量PCR（qPCR）

基于克隆得到的CsNLR-C6和CsNLR-C7基因的核心片段序列，用Primer3（https：／／primer3.ut.ee／）設計實時熒光定量PCR引物（表1），選用β-actin為內參基因。以4尾健康半滑舌鰨各個組織的cDNA為模板，檢測兩個基因的組織表達量；并以感染哈維氏弧菌后0、12、24、48、72、96 h的5條半滑舌鰨腎臟、鰓、腸、脾臟和肝臟組織的cDNA為模板，檢測哈維氏弧菌感染后兩個基因的表達量變化。使用SYBR?Premix ExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa，中國大連）進行熒光定量PCR反應，反應程序設置如下：95℃，30 s；95℃，3 s，60℃，33 s，40個循環；95℃，15 s；60℃，60 s；95℃，15 s。實驗數據采用相對表達量計算方法，即2-ΔΔCt法，經計算得到CsNLRC6和CsNLR-C7基因的相對表達量。數據以平均值±標準誤差的形式表現表達量變化倍數。使用IBM?SPSS?統計平臺（V.19.0）進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Turkey多重比較分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 CsNLR-C6和CsNLR-C7基因的ORF序列分析

以半滑舌鰨混合組織為模板，擴增得到CsNLR-C6和CsNLR-C7基因的ORF序列（GenBank登 錄 號 分 別 為：MZ753812，MZ753813）。其中，CsNLR-C6的ORF為3234 bp，編碼1078個氨基酸，預測蛋白相對分子量Mw為120.64 kDa，理論等電點pI為6.50；CsNLR-C7的ORF為2961 bp，編碼987個氨基酸，預測蛋白相對分子量Mw為112.68 kDa，理論等電點pI為6.04。SMART軟件預測結果顯示，兩個蛋白均含有1個FISNA結構域，1個NACHT結構域，1個B30.2（PRY／SPRY）結構域；此外，CsNLR-C6包含5個LRR結構域（圖1-A），而CsNLR-C7包含4個LRR結構域（圖1-B）。半滑舌鰨NLR-A亞家族（NOD1-5）均含有NACHT結構域，并在靠近3′端含有數量不等的LRR結構域（圖2）。通過比較發現，半滑舌鰨NLR-C6和NLR-C7含有保守的NACHT結構域和LRR結構域，說明NACHT結構域和LRR結構域廣泛地存在于半滑舌鰨NLR家族中，而FISNA結構域和B30.2結構域是半滑舌鰨NLR-C亞家族特有的。

圖1 半滑舌鰨CsNLR-C6（A）和CsN LR-C7（B）ORF及其氨基酸序列Fig.1 The ORFs and deduced amino acid sequences of CsNLR-C6 and CsNLR-C7

圖2 半滑舌鰨NLR家族的功能域分析Fig.2 Functional domain analysis of NLR family in Cynoglossus semilaevis

2.2 系統進化樹分析

為了探究CsNLR-C6和CsNLR-C7在脊椎動物中的進化關系，使用IQ-TREE軟件對人類、斑馬魚、尼羅羅非魚和半滑舌鰨的NOD1-5以及NLR-C構建了系統進化樹（圖3）。在進化樹上，這些蛋白被分成了6個進化枝：NOD1、NOD2、NOD3、NOD4、NOD5以 及NLR-C。CsNLR-C6、CsNLR-C7與尼羅羅非魚、斑馬魚的NLR-C組成一支，與NOD3的進化關系較近。而在其余的進化枝中，半滑舌鰨、尼羅羅非魚與斑馬魚的進化地位均較為接近。

圖3 NLR家族的系統進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of NLR family in representative species

2.3 CsNLR-C6和CsNLR-C7基因的組織表達分析

為了檢測CsNLR-C6和CsNLR-C7基因在健康魚體組織中的表達分布，采用qPCR方法檢測了這兩個基因在心臟、肝臟、頭腎、鰓、腦、腎、皮膚、脾、胃和肌肉組織中的表達量。結果表明（圖4），CsNLR-C6在免疫相關組織如鰓、腸、皮膚、脾中具有較高的表達量，而CsNLR-C7在免疫相關組織如鰓、頭腎、肝中具有較高的表達量。這兩個基因在肌肉組織中的表達量均較低。

圖4 CsNLR-C6（A）和CsNLR-C7（B）在半滑舌鰨健康組織中的表達模式Fig.4 Expression profiling of CsNLR-C6（A）and CsNLR-C7（B）in normal tissues of Cynoglossus semilaevis

2.4 哈維氏弧菌侵染半滑舌鰨后CsNLR-C6和CsNLR-C7基因的表達分析

為了探究CsNLR-C6和CsNLR-C7基因對哈維氏弧菌感染的響應模式，以0 h為對照，分析了這兩個基因在哈維氏弧菌感染12 h、24 h、48 h、72 h和96 h后鰓、腸、腎臟、脾臟和肝臟組織中的表達模式變化。結果如圖5所示，CsNLR-C6和CsNLR-C7基因在不同組織中的表達模式并不完全一致。在腸和脾中，兩個基因的表達量均在感染48 h后顯著上調（P＜0.05）；在鰓和腎臟中，CsNLR-C6基因的表達量分別在感染48 h和感染12 h后顯著上調（P＜0.05），而CsNLR-C7基因的表達量均在感染12 h后顯著下降（P＜0.05）。而在這兩個組織中，CsNLR-C7基因在感染24 h后呈現出不同趨勢：在鰓中，CsNLR-C7基因表達量持續維持在相比0 h顯著降低的水平上；而在腎臟中，CsNLR-C7基因表達量有所升高，并在感染48 h后較0 h提高（1.70±0.28）倍（P＜0.05），之后又漸漸回落至正常水平。在肝臟中，CsNLR-C6基因的表達量在感染12 h后有所升高，但與0 h相比并無顯著差異，之后一直維持在穩定水平上；而CsNLR-C7基因的表達量在感染48 h后顯著升高（P＜0.05）。

圖5 半滑舌鰨CsNLR-C6和CsNLR-C7在哈維氏弧菌感染后鰓（A）、腸（B）、腎（C）、脾（D）、肝（E）的表達模式變化Fig.5 Expression profiling of CsNLR-C6 and CsNLR-C7 in gill（A），intestine（B），kidney（C），spleen（D），and liver（E）at different time after V.harveyi infection

3 討論

胞內NOD樣受體是炎癥小體復合物的主要組成部分，主要作用為保護機體免受外來微生物病原的侵害［23］。本研究對半滑舌鰨中NOD樣受體家族中的CsNLR-C6和CsNLR-C7進行了克隆和表達分析。通過功能域預測，這兩個蛋白都含有NOD樣受體家族保守的NACHT結構域，并含有4～5個包含配體結合位點的LRR結構域。CsNLR-C6與CsNLR-C7包含不同數量的LRR結構域，說明它們可能結合不同類型的病原體。此外，與其他NOD亞家族不同的是，CsNLR-C6和CsNLR-C7還具有C端的FISNA結構域和N端的B30.2結構域。FISNA結構域為魚類特有的NACHT類子結構域，但其功能還不清楚［24］。三分模體包含蛋白和含熱蛋白結構域分子中的B30.2結構域已被證實可與配體結合，從而調控先天免疫反應［25-26］。鮸中18個含B30.2結構域的NLR-C亞家族基因可識別病原體入侵，并在抗病毒免疫應答過程中起到重要作用［8］。因此，半滑舌鰨可能通過NLR-C的FISNA、NACHT、LRR和B30.2結構域的協同工作，識別病原體并啟動相關的免疫信號通路。

在系統進化分析中，CsNLR-C6、CsNLR-C7與其他魚類的NLR-C蛋白聚類。相比其他NOD亞家族，NLR-C與NOD3的進化關系較近，這與斑馬魚、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）NLR-C的進化分析結果一致［3，23］，說明NLR-C與NOD3有最近的共同祖先（most recent common ancestor）。

NOD樣受體家族基因廣泛分布在哺乳動物和魚類的各個組織中。作為NOD樣受體家族成員，CsNLR-C6和CsNLR-C7在半滑舌鰨的各個組織中均有表達，但CsNLR-C6在鰓、腸、皮膚、脾中有較高表達，而CsNLR-C7在鰓、頭腎、肝中有較高表達。鰓、腸、皮膚是黏膜相關淋巴組織，具有淋巴細胞、巨噬細胞等，是魚體抵御病原微生物的有效防線［27］。頭腎、脾臟、肝都是參與魚類先天免疫的重要器官：頭腎承擔了造血和內分泌的功能；脾臟具有造血和免疫功能，在體液免疫和炎癥反應中起到重要作用；肝幫助魚體抵御外源異物侵害［28-29］。兩個基因在這些組織高表達，表明了它們具有重要的免疫功能，但不同的組織表達模式說明CsNLR-C6和CsNLR-C7可能在半滑舌鰨免疫應答中起到不同的作用。大菱鲆的兩個NLR-C基因在不同的組織中也表現出不同的表達水平，NLR-C3a在鰓和頭腎中高表達，而NLR-C3b在血液、脾和頭腎中表達量較高［9］。此外，NLR-C基因在不同魚類中的組織表達模式不盡相同。牙鲆的NLR-C基因在腎、鰓和血液中高表達［7］；鯉（Cyprinus carpio）的NLR-C基因在血液、脾和鰓中高表達［30］；斑馬魚的NLR-C基因在肝、腸和脾中高表達［3］。這些研究結果表明，NLR-C基因表達在不同種屬的魚類中具有一定的組織特異性。

目前已有研究表明，魚類NLR-C基因對細菌感染具有快速響應模式。在哈維氏弧菌感染的紅鰭東方鲀頭腎組織中，NLR-C10和NLR-C12的表達量分別在感染后4 h和12 h顯著升高［23］。鰻弧菌感染鯉的腸、皮膚、肝、脾和頭腎組織中，NLR-C基因的表達量在3～6 h內均有顯著升高［30］。在鰻弧菌感染的鮸脾臟組織中，NLR-C39和NLR-C40的表達量呈現不同應答模式：NLRC39的表達量在感染后24 h顯著降低，隨后在48 h內恢復并顯著升高；而NLR-C40的表達量則在感染后顯著升高，在24 h達到峰值［8］。本研究檢測了半滑舌鰨鰓、腸、腎、脾、肝組織中CsNLR-C6和CsNLR-C7在哈維氏弧菌感染后的表達量變化。結果表明，兩個基因在不同組織中呈現出對哈維氏弧菌感染不同的響應模式。在腸和脾中，兩個基因的表達量都在感染后48 h內顯著升高，表明CsNLR-C6和CsNLR-C7都參與了半滑舌鰨抗哈維氏弧菌的免疫應答反應。在腎臟中，CsNLR-C6基因響應更快，在感染后12 h內其表達量就顯著升高，并持續升高，在感染后24 h至96 h內一直保持在較高的水平，說明腎臟一直處于哈維氏弧菌感染的應答狀態；在肝中，CsNLRC7則表現出更強烈的響應，其表達量在感染后48 h內顯著升高。而在鰓中，兩個基因的表達趨勢相反，CsNLR-C6隨著哈維氏弧菌侵染表達逐漸升高，而CsNLR-C7隨哈維氏弧菌感染表達降低，并一直處于較低水平，說明兩個基因對于鰓中免疫反應的應答模式不同。在哈維氏弧菌感染的半滑舌鰨腎臟中，CsNOD1、CsNOD2和CsNOD3、CsNOD4也呈現出相反的應答模式［16］。

本研究克隆了半滑舌鰨CsNLR-C6和CsNLRC7的ORF，分析其結構域和系統進化地位，并對其組織表達模式和感染哈維氏弧菌后在不同組織中的應答模式進行了檢測，結果表明，CsNLRC6和CsNLR-C7基因均參與了半滑舌鰨抗哈維氏弧菌的免疫反應，這為今后魚類特有的NLR-C基因家族在魚類先天免疫反應中的作用機制研究提供了實驗數據和理論基礎。