南海近海浮游細菌群落結構和多樣性研究

孫 濤，付 婧，周 進

（1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090）

南海是世界第三、太平洋西部最大的邊緣海，最大深度可超過5000 m，具有復雜的物理化學環境。黑潮、季風、上升流和渦旋等物理力量的干擾較為顯著地影響南海水體物理化學性質，造就其區域高度異質化的生境空間［1-3］。細菌是海洋微生物中的優勢類群，廣泛參與海洋生源要素的生物地球化學循環，已有研究報道，南海水域微生物多樣性水平較高［4-6］。

針對南海水域細菌的物種多樣性和群落結構已有較好研究基礎。然而，現階段海洋群落生態學研究多依賴于數量較為有限的現場采集，此種基于有限數量樣本的群落結構描述與實際數據之間尚存差距。南海區域遼闊，海況通常較為惡劣，海洋研究樣品采集成本較高。已有南海細菌群落結構和多樣性研究中樣品采集站位數量通常較少，站位數多為十余個至數十個［4-7］，研究覆蓋的區域范圍較為有限，因此以大范圍采樣為基礎的南海細菌群落研究具有重要意義。南海水體總體處于寡營養狀態，珠江河口和陸域徑流向海域輸入的營養物質，易在海域內形成沿岸至深海漸變的細菌生境，此種漸變生境可能在較小的空間范圍內具有較為明顯的理化環境條件梯度［9］。揭示此種梯度化生境條件下的細菌群落結構可為理解南海環境異質性提供生物學證據。

已有針對南海細菌群落的研究多探討表層海水中細菌群落的空間分布特點以及細菌在水體環境中的垂直分布［6］。研究發現，南海海水中細菌類群受到理化環境因素的影響，上層海水中細菌豐富度和多樣性隨深度增加而增加，垂直分布較為顯著［10-11］。也有研究發現，南海表層細菌群落具有生態類型（沿岸和海洋區）和中尺度物理過程的兩級空間分布模式［6］。以往針對南海細菌的空間分布和垂直分布特征研究，多數研究調查站位較少，采樣范圍較為有限［4-7］，采樣范圍未覆蓋南海東北部、瓊東和北部灣等南海近岸典型水域等，或者是研究一些特定的生境，如上升流、冷泉等［12-13］。伴隨分子生物學技術方法的發展，細菌的多樣性及其分布格局有望得以深入研究。

本研究在南海海域實現了較大規模的海水細菌樣品采集，采集范圍覆蓋南海東北部、瓊東和北部灣等南海近岸典型水域。研究旨在描述南海近海浮游細菌多樣性、群落結構及其空間分布特征，基于較大樣品采集信息的分析研究有望更為科學、客觀地揭示南海細菌分布格局，以期為南海微生物資源開發利用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本研究在南海水域設置50個采樣站位（圖1），采樣區域主要包括南海東北部、瓊東和北部灣共3個區域。利用船載玫瑰花式采水器采集表層（0～5 m）和底層海水（部分站位）樣品各2 L，樣品通過負壓過濾方法抽濾至0.22μm聚碳酸酯膜（Merck-Millipore，Iceland），濾膜樣品立即轉移至無菌凍存管，置于液氮中保存。樣品采集搭載國家自然科學基金委和廣東海洋大學組織的開放航次，樣品采集時間為2018年6—8月。

1.2 基因組DNA提取與16Sr RNA高通量測序

在無菌條件下將濾膜樣品剪碎，按照DNA提取試劑盒（FastDNA?Spin Kit for Soil，MP Biomedicals）規定步驟嚴格進行基因組DNA抽提。利用NanoDrop 2000分光光度計2000c（Thermo Fisher Scientific Inc.，Wilmington，DE，USA）檢測DNA提取物的濃度（ng·μL-1），利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA抽提質量。

利用16SrRNA基因V3-V4高變區序列信息鑒定微生物物種。選取10 ng高濃度和高質量DNA為模板，使用帶有barcode的特異正向引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和 反向引物806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）擴增V3-V4 rRNA靶區域，共進行3次擴增［14］。PCR擴增反應條件為：95℃預變性3 min，循環35次（95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s）；最后72℃延伸10 min，10℃保存。擴增體系（20μL）：5×FastPfuBuffer 4μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）2μL、正向引物Forward Primer（5μmol·L-1）0.8μL、反向引物Reverse Primer（5μmol·L-1）0.8μL、FastPfuPolymerase 0.4μL、BSA 0.2μL、Template DNA 10 ng、補ddH2O至20μL。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統（Promega Corporation，Madison，WI，USA）進行定量檢測。按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合，構建Miseq文庫。高通量測序由美吉生物醫藥科技有限公司（上海）使用Miseq PE300（Illumina Inc，San Diego，CA，USA）測序平臺完成，測序策略為2×300 bp。

本研究所使用的原始序列已上傳至NCBI的SRA數據庫，登錄號為SRX11623561-SRX11623624。

1.3 數據處理和生物信息學分析

根據overlap關系對Miseq測序得到的PE reads進行拼接，同時對序列質量進行質控拼接和過濾，去除引物序列和含barcode序列，優化測序數據。利 用Usearch［15］（version 7.1 http：／／drive5.com／uparse／）軟 件 平 臺（UPARSE［16］：highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads）對非重復序列（不含單序列）進行聚類，根據97%的序列相似度歸類產生操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。聚類過程中去除嵌合體。

采用RDP classifier貝葉斯算法［17］（置信度閾值為0.8）對OTU代表序列進行比對注釋，對照Silva數據庫［18］（silva138／16s_bacteria，http：／／www.arb-silva.de）匹配各OTU的分類信息。匹配至葉綠體（chloroplast）、線粒體（mitochondria）、古菌（Archaea）和未歸類的OTU，以及相對豐度小于序列總數0.01%的OTU未被包括在后續群落結構分析之內。

1.4 細菌群落多樣性分析

本文基于α-和β-多樣性兩個角度描述研究區域細菌群落的結構特征和多樣性水平。α-多樣性分析時計算如下參數：OTU數量（OTUs）、覆蓋度（Good's coverage，G）、多樣性指數（Shannon-Wiener，SW）、單純度指數（Simpson）和豐富度指數（Chao 1，Ace）。使用QIIME［19］（1.9.1，http：／／qiime.org／install／index.html）軟件運行core_diversity_analyses.py腳本文件計算α-多樣性指數。數據類型不符合正態分布和方差不齊，選用Wilcoxon秩和檢驗（Wilcoxon rank-sum test）判別群落多樣性和豐富度指數在各采樣區域之間是否具有顯著差異。

基于Bray-curtis非相似性系數，利用UPGMA聚類方法分析不同樣品之間16SrRNA基因序列的相似性，并利用非度量多維尺度分析方法（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）揭示不同樣品之間的差異性，使用ANOSIM檢驗NMDS組間差異顯著性。根據采集樣品的細菌組成以及不同類群相對豐度繪制熱圖，研究水體細菌組成的空間差異。聚類和非度量多維尺度分析以及熱圖繪制利用R軟件完成。

利用LEfSe工具采用線性判別分析方法［20-21］（linear discriminant analysis，LDA）估算細菌組成對樣品空間差異的影響效果，鑒定水體樣品中的特異性細菌類群［13-14］。LDA值表征特定細菌類群相對豐度在不同樣品間的差異程度，具有較高LDA值的細菌類群可視為群落的生物標記物。本研究以LDA＞3作為生物標記物的篩選標準。

2 結果與分析

2.1 細菌群落α-多樣性

本研究共采集64個水體樣品。序列篩選后共獲取3041767條高質量16S rRNA基因序列（97%相似水平）和2891個優化OTU。單樣本序列數變化范圍為34457～68506。單樣本OTU數量變化范圍為241～1245，11號采樣站位表層水體樣品中OTU數量最低，33號站位底層樣品中OTU數量最高。如圖2所示，曲線逐漸趨于平坦，表明本研究測序量較為合理，測序深度足以反映采樣區域細菌的多樣性。

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves

本次采集樣品SW指數變化范圍為1.714～5.350，Simpson指數變化范圍為0.014～0.430，Ace指數變化范圍為412.100～1601.303，Chao 1指數變化范圍為394.588～1601.056。Wilcoxon秩和檢驗（Wilcoxon rank-sum test）結果表明，調查海域底層樣品細菌多樣性指數顯著高于表層樣品（P＜0.05）；底層樣品之間無顯著差異；表層樣品之間也無顯著差異，但多樣性高值采樣站位通常出現在本次研究區域的東北部水域。

2.2 細菌群落組成分析

本研究采集樣品鑒定OTU隸屬于37門、101綱、243目、404科、753屬。其中13個門和20個綱中的OTU相對豐度超過1%。變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidota）是研究區域中4個具有數量優勢的門（圖3，圖4），各類群的平均相對豐度分別為39.24%、29.67%、10.97%和10.80%。其他相對豐度較低、但在大部分樣品中均會出現的門級分類單元包括Marinimicrobia_SAR406_clade（占本次鑒定序列總數2.41%）、SAR324_clade（Marine_group_B，1.95%）和綠彎菌門（Chloroflexi，1.05%）。

圖3 研究區域水體樣品門級水平的細菌組成Fig.3 Composition of bacteria at phylum level in samples from the study area

圖4 研究區域數量優勢細菌門類的相對豐度熱圖Fig.4 Relative abundance heat map of numerically dominant bacteria in the study area

本研究樣品中變形菌門共鑒定1038個OTU，豐度最高值出現在11號站位表層（占站位樣品OTU總數86.99%）。變形菌門序列數占11號站位的表層、42號站位的底層、34號站位的底層、41號站位的底層樣品序列總數75%以上。本次鑒定的變形菌門OTU中，397個隸屬于α-變形菌綱，635個隸屬于γ-變形菌綱，6個隸屬于unclassified_p_Proteobacteria。α-變形菌綱在11站位的表層（82.57%）和7站位的表層（56.52%）是最具數量優勢的綱，γ-變形菌綱在34站位的底層（78.99%）和42站位的底層（79.25%）樣品中是最具數量優勢的綱。

藍細菌門在本次各調查站位均有出現，此類群共鑒定30個OTU，相對豐度最高值出現在24號站位的表層樣品中（占站位樣品OTU總數75.88%）。c_Cyanobacteriia和 c_Sericytochromatia是藍細菌門中最具數量優勢的綱。擬桿菌門共鑒定388個OTU，分屬c_Bacteroidia、c_Kapabacteria和c_Rhodothermia綱。c_Bacteroidia包含OTU數量最多，共含377個OTU，豐度最高值出現在12站位的表層樣品中（43.58%）。放線菌門共鑒定144個OTU，分屬c_Actinobacteria、c_Acidimicrobiia、c_Coriobacteriia、c_Rubrobacteria、c_Thermoleophilia和unclassified_p_Actinobacteriota綱，豐度最高值出現在38站位的底層樣品中（32.24%）。

表1 各采樣站位OTU數量（97%相似水平）和多樣性指數Tab.1 OTU number（97% similarity level）and typical diversity index of sampling stations

·續表1·

2.3 細菌群落β-多樣性分析

NMDS和層級聚類分析表明，表層或底層海水中不同樣品細菌群落之間差異較小，表層和底層海水之間細菌的群落結構差異較大（圖5，圖6）。ANOSIM分析結果顯示，表、底層海水樣品間細菌群落結構差異達到極顯著性水平（R＝0.6403，P＝0.001）。

圖5 海水細菌群落結構NMDS分析Fig.5 NMDS analysis of bacterial community in water samples

圖6 海水樣品細菌群落的層級聚類分析Fig.6 Hierarchical cluster analysis of bacterial community of seawater samples

2.4 不同組間的細菌物種差異組成

如圖7所示，利用LEfSe分析工具的線性判別結果表明，典型地理區域內表層水體細菌群落的特征類群較為豐富。設定LDA值＞3，北部灣水域表層特征細菌類群包括g_Cyanobium_PCC_6307、f_Halieaceae和o_Cellvibrionales等類群，瓊東水域表層特征細菌類群包括 o_Rhodospirillales、g_norank_f_AEGEAN_169_marine_group和f_AEGEAN_169_marine_group，南海東北部表層水域特征細菌類群為o_Rhizobiales。相對于表層水體，底層水體樣品中細菌群落特征類群更為豐富，特征細菌類群可達26個，包括g_norank_f_norank_o_norank_p_SAR324_cladeMarine_group_B、f_norank_o_norank_c_norank_p_SAR324_cladeMarine_group_B和c_norank_p_SAR324_cladeMarine_group_B等類群。

圖7 南海水域中細菌群落的線性判別分析（僅顯示LDA值＞3的細菌類群）Fig.7 Linear discriminant analysis of bacterial community in South China Sea（only bacterial group with LDA＞3 were listed）

3 討論

3.1 南海水體浮游細菌群落多樣性

本研究發現，底層海水樣品中的細菌豐富度和多樣性要高于表層樣品，表現為層化現象，與全球層化模式較為相似［22］。已有針對南海浮游細菌群落研究報道的OTU數量多為數百個，例如YI等［23］調查南海海水中細菌垂直分布時報道表層細菌OTU數目范圍為696～886；張益［10］在瓊東5 m水層中發現浮游細菌OTU數量大多低于800個；南海范圍內沿14°等緯度線斷面5 m水層中得到的OTU數目為319～595［10］。本研究鑒定OTU數目范圍為241～1245，OTU數量較大，變化范圍較廣，顯示了南海浮游細菌較高的生物多樣性。

3.2 南海水體的細菌組成

本研究結果表明，南海水體中最具數量優勢的細菌類群包括變形菌門、藍細菌門、放線菌門和擬桿菌門，此4類群分別占采集樣品序列總數39.24%、29.67%、10.97%和10.80%。本研究揭示的南海水體中細菌群落優勢類群組成與已有相關報道一致［24-25］。

變形菌門細菌在南海水體環境中不僅出現頻率較高，而且通常具有較高的豐度。在變形菌門內，α-變形菌綱和γ-變形菌綱是本研究采集樣品細菌群落的主要組成成分。在表層海水中，α-變形菌綱的相對豐度大于γ-變形菌綱；在底層海水中，γ-變形菌綱相對豐度大于α-變形菌綱。此種分布特征在已有相關研究中曾有提及［5，24］，顯示了同類群海洋細菌具多樣化的環境適應能力。在目級分類水平，本研究樣品中的優勢類群與已有報道結論類似，例如α-變形菌綱主要包括紅桿菌目（Rhodobacterales）、SAR11類群、紅螺菌目（Rhodospirillales）、根瘤菌目（Rhizobiales）和鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales），γ-變形菌綱主要包括交替單胞菌目（Alteromonadales）、Cellvibrionales、SAR86類群、Thiomicrospirales和假單胞菌目（Pseudomonadales）。此類數量優勢類群的相對豐度在不同研究中存在差異，顯示類群具有異質性的時空分布特點。例如紅桿菌目相對豐度在細菌群落中的占比在大西洋和太平洋海水中大于25%［24］，在南海北部少數站位中為5.44%［24］，在本研究中為9.52%。

藍細菌門相對豐度在本次采樣的表層海水樣品中占據顯著數量優勢，在24號采樣站位的表層海水中的占比高達75.88%。底層海水中藍細菌門的相對豐度較低。藍細菌門細菌在海洋生態系統的碳循環和初級生產力形成中具有重要作用，并且為海洋生物提供碳源，本研究結論表明，藍細菌門在南海水域生態系統物質循環和能量流動中發揮重要作用。已有研究表明，原綠球藻屬、聚球藻屬藍細菌具有環境指示功能；原綠球藻屬廣泛分布在貧營養狀態海域，聚球藻屬喜居于營養豐富的水體環境［26-28］。在本次研究水域內，原綠球藻屬在北部灣海域豐度極低，而在南海北部的陸架開闊海域表層水體（例如36號站位）豐度較高；聚球藻屬在北部灣和南海北部沿海地區表層海水（例如24號站位）中豐度較高。藍細菌的此種空間分布特征表明，北部灣和南海北部沿海地區的營養鹽含量高于南海北部陸架開闊海域。

本研究區域內細菌群落結構可能與少數環境因子密切相關。例如，Marinimicrobia_SAR406_clade（Marine group A）和SAR324類群（Marine group B）是海水細菌中的重要類群，SAR406和SAR324類群在部分海水樣品（第43號站位）中的相對豐度分別高達12.64%和10.12%。此2類群豐度在同站位表、底層水體中存在較為顯著的差異，底層海水樣品中的相對豐度較高。研究表明，SAR406和SAR324類群在南海、大西洋、太平洋海水垂直方向上的豐度差異與水體中溶解氧含量相關，水體溶解氧含量伴隨深度增加而減少，此2類群在低氧區內具較高豐度［29-31］。

3.3 南海水體細菌的分布特征

細菌是南海生態系統中最具數量優勢的生物類群，但是至今針對此區域內細菌多樣性、空間分布特征以及群落和環境因子相關性等方面的認知仍較為有限。本研究采樣范圍較廣，可提供較為少見的海盆尺度的空間分布特征分析。

本研究結果表明，南海表層或底層樣品之間細菌群落多樣性指數無顯著差異（Wilcoxon秩和檢驗，P＞0.05），樣品間細菌群落結構較為相似（UPGMA聚類方法分析），區域內浮游細菌群落總體上未呈現出顯著的空間異質性。盡管如此，細菌群落的多樣性高值區通常出現在本次研究區域的東北部水域。此種差異應與東北部水域的環境特征相關。東北部采樣水域在經度上位于珠江河口的兩側，在緯度上覆蓋淺海至近千米深海，區域具有較高的環境異質性。珠江按流量是我國第二大河流，年徑流量超過3492億m3。珠江巨大的淡水輸入在河口區域形成較為明顯的鹽度梯度。淺海和深海與陸地距離存在顯著差異，陸源營養物質對區域的影響存在差別。此外，南海海洋動力過程具有季節性的多尺度變化特征，南海東北部上升流、海洋鋒面、中尺度和次中尺度渦旋均可能影響海洋細菌分布格局及其多樣性［32-33］。

南海水域細菌的垂直分布特征暫無較為明確的結論。部分研究表明，南海光合作用帶范圍內的細菌多樣性和豐富度隨水體深度的增加而增加［31］，全球范圍尺度上也是如此［22］。有研究認為，細菌在65 m水深處豐度最大，此區域通常也是葉綠素a含量的高值區［33］。海洋水文動力復雜，魚類糞便、上升流引起的營養物質輸入也可能在較深的水體形成細菌高值區［33-35］。本研究結果顯示，南海水域細菌的垂直分布顯示出顯著的異質性。首先，底層水體樣品中出現特異性細菌類群。Nitrospinota類群在南海北部底層海水樣品中較為常見，在各采樣站位中的相對豐度維持在較高水平（0.18%～8.82%，最低值和最高值分別出現在第38號和第47號站位）。KITZINGER等［36］利用酶聯熒光原位雜交技術在表層海水中未發現Nitrospinota，而在表層以下不同水層均發現一定豐度Nitrospinota，并且隨著海水深度逐漸增加直至到沉積物之上。Nitrospinota是海洋中最豐富的亞硝酸鹽氧化細菌，是海洋中氮循環的重要參與者［37］。少數研究表明，Nitrospinota在黑暗海洋中固定15%～45%的碳［37］。其次，采樣區域底層樣品中細菌群落多樣性顯著高于表層（Wilcoxon秩和檢驗，P＜0.05）。本次調查Shannon指數位于前10位的樣品均采集于底層水體，其中33號站位底層水體細菌群落的Shannon指數最高。此外，部分OTU在不同水層中豐度存在顯著差異。SAR11clade等在表、底層皆有分布的類群在底層水體具有更高的豐度。

南海是個開闊的海洋，受到諸如黑潮、季風、環流、上升流、渦流等物理因素以及珠江口等河口輸入的影響，具有復雜的物理化學環境。本研究顯示的底層水體細菌群落的較高多樣性很可能與上升流影響有關。南海北部陸架海域主要的上升流區分別為閩南沿岸上升流、臺灣淺灘上升流、粵東上升流、粵西上升流和瓊東沿岸上升流。上升流將高營養鹽的低溫深層水帶至真光層，能夠改變上層海洋生態系統的微生物群落結構［38］。在上升流區域，CO2濃度的增加、營養物質的輸入等情況能夠顯著提高該區域的初級生產力［39-40］。上升流區域底層水體中的細菌密度、生物量和細胞更大［34-35］。汪彧等［41］針對瓊東海域上升流的觀測研究指出，區域內強上升流影響區域主要包括海南島東岸離岸100 km以內的30～50 m水體，此區域與本次研究的部分采樣水域重合（43～50號站位），較為直接地證明了上升流對區域細菌多樣性的促進作用。