基于網絡藥理學和分子對接技術探討八珍湯治療壓瘡的作用機制

陸海艷 牧晶 孫連祺 黃禾青 于道遠 杜冠潮 代紅雨

〔摘要〕 目的 采用網絡藥理學方法和分子對接技術探討八珍湯治療壓瘡的作用機制。方法 通過中藥系統藥理學技術平臺（TCMSP）、UniProt、DrugBank數據庫獲取八珍湯中藥物的活性成分及其潛在的作用靶點。借助OMIM數據庫和GeneCards數據庫檢索壓瘡的相關靶點，獲取藥物與疾病的交集靶點并將其導入STRING數據庫進行蛋白互作分析，通過Cytoscape 3.7.2軟件將互作結果可視化。運用DAVID平臺對交集靶點進行GO和KEGG富集分析，預測八珍湯治療壓瘡的可能機制與通路。通過AutoDock Vina軟件對核心活性成分和靶點進行分子對接驗證。結果 檢索出八珍湯中有效活性成分150個，潛在靶點230個，涉及壓瘡的靶點有131個。核心成分有槲皮素、柚皮苷、山柰酚等，關鍵靶點涉及AKT1、IL-6、MAPK1、MAPK8、STAT3、VEGFA、EGF、IL-1β等。GO功能富集分析得到345個條目，其中生物過程256個、細胞組成38個、分子功能51個。KEGG通路富集篩選得到116條信號通路，PI3K-Akt、HIF-1、VEGF、MAPK、TNF等信號通路是八珍湯治療壓瘡重要的潛在通路。同時，分子對接結果表明槲皮素、山柰酚、查爾酮A、柚皮苷、芒柄花素與AKT1、IL-6、MAPK1、MAPK8、STAT3、VEGFA、EGF、IL-1β有很好的結合能力。結論 八珍湯治療壓瘡具有多成分、多靶點、多通路的治療特點，可能通過調節炎癥反應、促進血管生成、抑制細胞凋亡等途徑促進壓瘡愈合。

〔關鍵詞〕 八珍湯;壓瘡;網絡藥理學;分子對接;作用機制;信號通路

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.017

Mechanism of Bazhen Decotion for Pressure Ulcer Based on Network

Pharmacology and Molecular Docking Technology

LU Haiyan1， MU Jing2， SUN Lianqi3， HUANG Heqing1， YU Daoyuan1， DU Guanchao4， DAI Hongyu3*

（1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2. Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming，

Yunnan 650500， China; 3. Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China;

4. Graduate School of Chinese Academy of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100700， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the mechanism of Bazhen Decotion in the treatment of pressure ulcer by using network pharmacology and molecular docking technology. Methods Through traditional Chinese medicine system pharmacology （TCMSP）， UniProt database and DrugBank database， the active ingredients and possible targets of Bazhen Decotion were obtained. Relevant targets for pressure ulcer were retrieved by using OMIM and GeneCards databases. The common targets of drugs and disease were obtained and imported into the STRING database to make protein interaction analysis. The interaction result was visualized by Cytoscape 3.7.2 software. GO and KEGG enrichment analysis were performed on the common targets in the DAVID database to predict the possible mechanism and pathway of Bazhen Decotion in treating pressure ulcer. The molecular docking analysis of core active components and core targets was carried out by using AutoDock Vina software. Results A total of 150 effective active components combined with 230 potential targets were searched from Bazhen Decotion， of which 131 targets involved in pressure ulcer. The core components were quercetin， naringenin， kaempferol， etc. The key targets were AKT1， IL-6， MAPK1， MAPK8， STAT3， VEGFA， EGF， IL-1β， etc. There were 345 GO entries， including 256 items of biological process， 38 items of cell composition， and 51 items of molecular function， and 116 KEGG pathways were enriched and screened. PI3K/Akt， HIF-1， VEGF， MAPK， TNF and other signaling pathways were important potential pathways of Bazhen Decotion in the treatment of pressure ulcer. At the same time， the molecular docking results showed that quercetin， kaempferol， licochalcone A， naringenin， formononetin had good binding ability with AKT1， IL-6， MAPK1， MAPK8， STAT3， VEGFA， EGF， and IL-1β. Conclusion The mechanism of Bazhen Decotion in the treatment of pressure ulcer involves multiple components， multiple targets and multiple pathways. It can promote the healing of pressure ulcer by regulating inflammatory response， promoting angiogenesis and inhibiting apoptosis.

〔Keywords〕 Bazhen Decotion; pressure ulcer; network pharmacology; molecular docking; mechanism; signal pathway

壓瘡是由于身體局部組織長期受壓，發生持續性缺血和缺氧而導致的皮膚和（或）皮下組織的局部損傷[1]。根據損傷程度的不同壓瘡有不同的臨床表現，嚴重者可引起全身感染，危及生命。隨著人口老齡化社會的來臨，壓瘡已成為一個越來越嚴重的慢性病并發癥，世界傷口愈合聯合會證實壓瘡的高發及難愈合會導致患者住院周期延長、生活質量下降，同時造成醫療資源的占用，帶來嚴重的社會負擔[2-3]。中醫藥在壓瘡的治療上有著悠久的歷史和獨特的優勢，壓瘡屬于中醫學“席瘡”“褥瘡”“潰瘍”等范疇，雖發生于局部皮肉筋骨，屬外證，然其“必先受于內，然后發于外”，故在治療時應注重內治法的應用，從整體上調節五臟六腑氣血。中醫內治法是瘡瘍治療的重要方法[4]，其中補法是瘡瘍內治的三大法則之一。中醫學認為壓瘡是由于久病臥床，氣虛血瘀，血脈不通，肌膚失養所致[5]。壓瘡患者的全身狀態較差，多因其自身基礎疾病的消耗所致，加之久臥傷氣，導致氣血益虧，正氣不足，創面愈合困難。氣血兩虛證是壓瘡的常見證型之一，針對這一病機，補益氣血法在壓瘡的治療中發揮著重要的作用[6-7]。

八珍湯源自古方《正體類要》，為氣血雙補代表方劑，臨床常用于治療氣血兩虛諸證，包括壓瘡的臨床治療[8-9]?！锻饪普凇芳啊动兛菩牡眉肪涊d其可治療瘍科氣血俱傷，久不收斂等潰瘍諸證?！动彲儓D譜》治療壓瘡以補益氣血、托毒生肌為法，方藥選用八珍湯內服[10]。有實驗研究[11]證明，八珍湯能上調大鼠創面血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的表達水平，改善局部組織的缺血狀態，誘導新生血管形成，從而促進創面修復愈合。八珍湯還可促進人皮膚成纖維細胞增殖及表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）、轉化生長因子β1（transforming growth factor β1， TGF-β1）等分泌，從而加速血管再生，促進肉芽組織生長及創面上皮化，有助于創面愈合[12]。李靜等[13]用八珍湯內服聯合外敷治療壓瘡20例，總有效率達95%。李倩、靳楠楠等[14-15]研究發現，加用八珍湯內服用于壓瘡的治療較單純對照組臨床療效更顯著。但目前八珍湯治療壓瘡的作用機制尚不明確。網絡藥理學是系統生物學重要的組成部分，能建立“成分-藥物-靶點-疾病”多重網絡關系，從整體上探索中藥復方治療疾病的作用機制，與中醫藥治療疾病的整體觀相吻合[16]。因此，本研究旨在運用網絡藥理學的方法篩選出八珍湯與壓瘡相關的活性分子和靶點，構建成分-靶點網絡，并對靶點進行富集分析，結合分子對接驗證來預測中藥復方八珍湯治療壓瘡的潛在作用機制，以期為基礎研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 ?八珍湯成分、靶點篩選

通過中醫藥系統藥理學平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/index.php）查找八珍湯中八味中藥的活性化學成分，設置口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness， DL）≥0.18進行篩選，獲得八珍湯中八味中藥的活性成分。通過TCMSP數據庫、DrugBank數據庫（https：//go.drugbank.com/）得到潛在的蛋白質靶點，將篩選出的蛋白質靶點在UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org）轉換為標準化的基因名稱。

1.2 ?壓瘡相關靶點篩選

分別在OMIM數據庫（http：//www.omim.org）和GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org）中以“pressure ulcer”為關鍵詞進行檢索，獲得與壓瘡相關的靶點基因。若GeneCards數據庫中檢索到的靶點過多，可根據Score值來篩選靶點的數量。Score值越大則說明靶點與疾病的關聯性越強，通常設定Score值大于中位數的靶點為疾病的潛在靶點。將兩個疾病數據庫獲得的靶點合并去重后得到壓瘡的相關靶點。

1.3 ?有效靶點的獲取及相關作用網絡的構建

利用韋恩圖將八珍湯靶點與壓瘡靶點取交集，獲得二者的交集靶點，即為八珍湯治療壓瘡的有效靶點。將有效靶點導入STRING數據庫（https：//string-db.org），構建蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡，選取可信度≥0.7的數據，將結果以tsv格式導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化分析。

1.4 ?“活性成分-有效靶點”網絡構建分析

將藥物活性成分與有效靶點基因導入Cytoscape 3.7.2軟件進行網絡構建及可視化分析，通過分析度值等網絡拓撲參數來評價藥物活性成分及其作用靶點的重要性。

1.5 ?靶點功能與通路的富集分析

將有效靶點導入DAVID數據庫中進行GO注釋分析與KEGG通路分析（P<0.05），GO富集分析主要分為3類，包括生物過程（biological process， BP）、分子功能（molecular function， MF）和細胞組成（cellular component， CC）。

1.6 ?分子對接驗證

利用分子對接模擬軟件AutoDock Vina，對可能發揮作用的主要活性成分及處于PPI網絡中的核心靶點進行對接模擬計算。在PDB數據庫中獲得靶點及配體的結構，利用PyMoL和AutoDock Vina軟件將其與活性成分分別進行對接。全部對接完成后，根據活性成分和核心靶點最低結合能的數值來評價八珍湯活性成分與靶點的結合能力。

2 結果

2.1 ?八珍湯活性成分及相關靶點的獲取

在TCMSP數據庫中以OB≥30%且DL≥0.18為條件進行篩選，獲取八珍湯中所含藥物的活性化學成分，得到人參有效成分22個、白術7個、茯苓15個、甘草92個、當歸2個、熟地黃2個、白芍13個、川芎7個，去重后得到有效成分共150個，部分活性成分見表1。通過TCMSP數據庫、UniProt數據庫、DrugBank數據庫，檢索到人參靶點256個，白術23個、茯苓30個、甘草1769個、當歸69個、熟地黃34個、白芍123個、川芎42個，去重后共得到230個潛在作用靶點。

2.2 ?壓瘡相關靶點獲取

從GeneCards數據庫獲得壓瘡靶點4882個，根據經驗設定Score大于中位數的靶點為疾病潛在靶點，如通過GeneCards所得壓瘡靶點Score最大值為76.5，最小值為0.15，中位數為2.63，故設定Score>2.63的靶點為壓瘡的潛在靶點。結合OMIM數據庫檢索獲得的相關靶點，合并后刪除重復值，最終得到1496個壓瘡相關靶點。

2.3 ?交集靶點PPI網絡的構建

利用韋恩圖工具將八珍湯靶點與壓瘡靶點取交集，獲得二者的交集靶點131個，見圖1。將交集靶點上傳至STRING數據庫，設置可信度≥0.7，得到靶點PPI網絡圖，并將數據以tsv格式導入Cytoscape 3.7.2軟件繪制蛋白關系網絡圖。網絡中共有126個節點 （靶點蛋白）、927條邊（PPI），見圖2。節點越大，對應的度值越大，度值越大說明越處于網絡核心位置。結果表明，處于該PPI網絡中心的靶點有AKT1、IL-6、MAPK1、MAPK8、STAT3、VEGFA、EGF、IL-1β等，推測其為八珍湯治療壓瘡的重要靶點，見表2。

2.4 ?中藥活性成分-有效作用靶點網絡圖的構建

運用Cytoscape 3.7.2構建八珍湯活性成分與有效靶點網絡，見圖3。通過軟件計算八珍湯治療壓瘡網絡的拓撲學參數，從而用來評價活性成分和作用靶點的重要性。結果發現，槲皮素、山柰酚、查爾酮A、柚皮苷、芒柄花素等活性成分可作用于多個靶點，這些成分可能是八珍湯治療壓瘡的主要活性成分，見表3。

2.5 ?靶點功能與通路的富集分析結果

利用DAVID數據庫對有效靶點進行GO注釋分析，分別選取BP、CC、MF中20個排名最靠前的結果，發現這些靶點BP主要涉及凋亡的負調控、基因表達的正調控、血管生成的正調控、對有機物的應答、對缺氧的應答、對脂多糖的應答、老化等。MF主要涉及酶結合、蛋白質結合、轉錄因子結合、血紅素結合、蛋白質均二聚活性等。CC主要涉及細胞間隙、胞外區和細胞膜、線粒體、細胞核等方面。結果見圖4A、4B、4C。

KEGG富集分析出來的信號通路共116條，包括癌癥通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、VEGF信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路等，選取其中前20條通路將其可視化，見圖4D。

2.6 ?分子對接驗證結果

將度值排名前5的藥物主要活性成分（槲皮素、山柰酚、查爾酮A、柚皮苷、芒柄花素）與PPI網絡中的8個核心靶點（AKT1、IL-6、MAPK1、MAPK8、STAT3、VEGFA、EGF、IL-1β）進行對接，對接最低結合能見表4?？梢钥闯?，所有的成分與靶點的最低結合能都小于0，說明二者能夠自發結合，最低結合能的數值越小說明成分與靶點蛋白結合的越好。對接結果顯示，5個活性成分與8個靶點的最低結合均能小于或者等于-5.0 kcal/mol，說明這些活性化合物與以上靶點結合活性較好，其中quercetin與STAT3的對接效果最好。見圖5。

3 討論

隨著老齡化社會的來臨，壓瘡的發病率越來越高，嚴重影響患者的健康，加重了家屬的護理負擔和社會的經濟負擔。中醫在壓瘡的治療上具有不錯的療效和簡便廉驗的特點?！锻饪普凇吩疲骸皻庋?，人之所原稟……人之命脈，全賴于此。百病生焉，失此豈能無變，獨瘡科尤關系不淺?！睔庋诏彲兊陌l生發展及轉歸預后中發揮著重要作用，氣血旺盛則不易發病，即使發病也能在正氣的沖托和箍束毒邪的作用下，易起、易潰、易斂。氣血兩虛證是壓瘡的常見證型之一，氣血兩虛證除了托毒生肌外，更重要的是需要補足正氣，運用中醫的各種方法大補氣血[17]。八珍湯為氣血雙補代表方劑，在創傷愈合領域應用廣泛，可用于壓瘡的治療、促進壓瘡修復愈合。

本文通過網絡藥理學方法對八珍湯進行研究，最終找到了150個潛在活性成分，預測了230個潛在靶點。將藥物成分靶點與疾病靶點交集后共獲得131個八珍湯治療壓瘡的有效靶點。在“活性成分-有效靶點”網絡圖中槲皮素、山柰酚、查爾酮A、柚皮苷、芒柄花素等成分可作用于多個靶點，推測其是八珍湯治療壓瘡的主要活性成分。槲皮素是分布廣泛的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化和免疫調節的作用[18]。在傷口治療方面，槲皮素可通過減少傷口部位過度的炎性反應、提高VEGF和TGF-β1的水平促進創傷修復愈合[19-20]。對于壓瘡的治療，研究[21]發現，槲皮素可減少免疫細胞浸潤和促炎性細胞因子的產生，并能通過抑制MAPK途徑改善缺血再灌注病變的傷口愈合過程，是壓瘡的潛在治療劑，可見槲皮素對于壓瘡等慢性傷口具有促進愈合的作用。Salehi Majid等[22]研究證實，柚皮苷對傷口愈合的過程具有積極作用，可在臨床上用于治療皮膚損傷。Luo Pei[23]發現板栗殼（CMS）對創傷愈合具有促進作用，此作用與山柰酚的抗炎活性有關。亦有實驗研究[24]證實，山柰酚是治療非糖尿病和糖尿病傷口的有效局部傷口愈合劑。這些成分均可能是八珍湯在壓瘡治療過程中發揮作用的重要成分。

從PPI網絡圖中可以看出靶點間存在多種相互作用，AKT1、IL-6、MAPK1、MAPK8、STAT3、VEGFA、EGF、IL-1β等靶點度值較大，可能與壓瘡的愈合密切相關。結合GO及KEGG結果分析，壓瘡重要的發生機制為組織缺血缺氧及再灌注損傷，在缺氧條件下，會產生多種促血管生成因子，包括缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1， HIF-1）和VEGF。HIF-1包括對氧敏感的HIF-1α和組成性表達的HIF-1β，缺氧時HIF-1α會穩定積累并與HIF-1β二聚化，轉移到細胞核中，并激活促血管生成的重要靶基因如VEGF的轉錄，從而促進血管再生[25-27]。創面傷口血管新生對于改善壓瘡尤為關鍵，VEGFA是最主要的VEGF，能促進內皮細胞的增殖和遷移，從而刺激新生血管的生成[28-29]，在創面愈合中具有重要作用。VEGFA表達減弱或降解加速都與創面愈合障礙相關，肖洪玲在大鼠壓瘡模型造模成功后發現模型組創面肉芽組織中VEGF含量明顯降低，提示壓瘡肉芽組織形成不良可能與此有關[30]。EGF是HIF-1/VEGF通路中重要的靶基因，它是細胞增殖和分化的關鍵調節劑，能刺激成纖維細胞和角質形成細胞的遷移和增殖以及膠原蛋白的沉積，能促進細胞外基質的增加及傷口的再上皮化從而加速創面愈合。傷口應用EGF能使上皮快速再形成并能減少感染風險[31-33]。八珍湯能上調大鼠創面VEGF的表達水平、促進人皮膚成纖維細胞合成分泌EGF、VEGF等 [11-12]，因此，八珍湯治療壓瘡可能通過作用HIF-1/VEGF通路調控新生血管形成，從而改善壓瘡組織的缺血缺氧狀態。AKT1是一種血清素蛋白激酶，它參與調節內皮細胞和血管平滑肌細胞功能，包括細胞生長、遷移、存活和血管形成。STAT3受PI3K/Akt/mTOR的調節，活化后的STAT3可促進血管新生。PI3K/Akt信號通路在促進血管網絡重建中也發揮了關鍵作用，可作為上游通路調控HIF-1、VEGF的表達來誘導血管的生成[34-36]。炎性反應在壓瘡形成過程中發揮著重要作用，TNF、MAPK信號通路是重要的炎癥通路，與壓瘡的發生發展密切相關[37-38]。壓瘡創面中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達高于正常皮膚組[39]，創面處于慢性炎癥狀態不利于組織修復愈合。八珍湯中多種成分均有抗炎作用，槲皮素能通過抑制MAPK通路激活來調節炎癥反應，發揮對壓瘡的治療作用，提示八珍湯可能通過調節炎癥反應促使壓瘡由炎癥期向增殖期轉化，從而促進創面愈合。研究表明，細胞凋亡是壓瘡發生、發展過程中的關鍵性因素[40-41]，PI3K/Akt信號通路是調控細胞凋亡的重要途徑。韓超[42]提出PI3K/Akt信號通路的激活對壓瘡缺血再灌注損傷的組織具有保護作用，當組織細胞發生缺血再灌注損傷時，活化的Akt可防止細胞凋亡。王晴[43]也通過實驗研究證實，局部低溫能通過作用于PI3K/Akt/GSK3β信號通路提高Akt和GSK3β的磷酸化水平，抑制凋亡因子Caspase-3激活以及細胞色素C釋放從而調控細胞凋亡、減輕大鼠壓瘡損傷。KEGG通路結果顯示，多個基因富集于PI3K/Akt信號通路，該信號通路是八珍湯治療壓瘡的重要通路之一，因此八珍湯可能通過激活該通路抑制細胞凋亡從而改善壓瘡組織的損傷。

本研究以八珍湯為研究對象，通過網絡藥理學方法，對八珍湯治療壓瘡的潛在作用靶點及作用機制進行了研究，推測八珍湯通過槲皮素、柚皮苷、山柰酚等成分發揮作用，通過作用AKT1、IL-6、MAPK1、MAPK8、STAT3、VEGFA、EGF、IL-1β等靶點影響PI3K/Akt、HIF-1/VEGF、MAPK、TNF等信號通路進而促進內皮細胞及血管的生成、調節炎癥反應、抑制細胞凋亡以促進壓瘡愈合。后期可對其進行實驗驗證，為明確其作用機制和藥物的推廣應用提供更高等級的循證證據。

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〔收稿日期〕2021-06-19

〔基金項目〕國家中醫藥管理局中醫藥行業科研專項（2015468001）;中醫藥繼續教育導航工程-繼教專委會建設及精品課程制作。

〔作者簡介〕陸海艷，女，在讀碩士研究生，研究方向：中醫藥治療慢性創面。

〔通信作者〕*代紅雨，男，博士，教授，主任醫師，碩士研究生導師，E-mail：dhy515@163.com。