厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量QTL定位及候選基因分析

楊 永，范 蓉，張學軍，李寐華，凌悅銘，張 紅，楊文莉，姜 雪，張永兵，伊鴻平

(1.新疆農業科學院哈密瓜研究中心，烏魯木齊 830091；2.伊犁師范大學生物與地理科學學院，新疆伊寧 835000)

0 引 言

【研究意義】甜味(糖含量)是衡量甜瓜品質的核心指標。由于間接反應可溶性糖總量的可溶性固形物含量測量簡便易行，在育種材料創制過程中，心部果肉和邊部果肉可溶性固形物含量是重要品質指標。而甜瓜果肉中可溶性糖可進一步分為葡萄糖、果糖和蔗糖三種組分，且以蔗糖為主，蔗糖含量和總糖含量呈極顯著正相關[1]，蔗糖含量的高低在很大程度上決定了果肉的甜味程度。厚皮甜瓜心部果肉可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖和果糖，其中蔗糖含量占比最高。準確定位控制厚皮甜瓜果肉蔗糖含量的主效QTL，并挖掘相關候選基因，對于厚皮甜瓜果肉品質的分子遺傳改良，創制高糖育種材料具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】甜瓜果實中3種可溶性糖含量隨果實發育而變化，其中果糖、葡萄糖呈先增加后變平緩或降低的變化趨勢，蔗糖呈持續增加的變化趨勢[1-4]。在幼果期，果糖、葡萄糖和蔗糖經過一系列的酶促反應，主要參與糖酵解、磷酸戊糖途徑和細胞壁物質合成等過程，為果實發育提供碳骨架和能量，蔗糖積累量很少或不積累；在果實發育后期，CmSPS1(蔗糖磷酸合成酶基因)和CmSPP1(蔗糖磷酸化酶基因)表達上調，引導糖代謝初始階段的產物用于蔗糖合成和儲存[3]，使得蔗糖含量在果實庫中迅速增加。QTL作圖是基因精細定位和克隆的基礎，是數量性狀遺傳研究的常用方法[5]。張寧等[6]認為蔗糖含量受一對加性主基因+加性-顯性多基因模型控制(D-2)，主基因在F2群體中具有較高的的遺傳率，達83.76%；而呂律[7]認為蔗糖含量受2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因(MX2-ADI-AD 模型)控制。張寧等[8]基于F2群體在第3和第4號連鎖群上，檢測到與總糖和果糖相關的QTL各一個，解釋遺傳變異率分別為14.89%和13.02%，未檢測到與蔗糖相關的QTL。Harel-Beja等[9]基于99個家系組成的重組自交系群體，在LG2、LG3、LG5、LG8四個連鎖群上共定位到7個與蔗糖含量積累相關的QTL位點。Argyris等[10]發現一個控制蔗糖和可溶性固形物含量的位點SUCQSC5.1，可減少蔗糖積累量達到34%，并推測該位點上的MELO3C014519基因對甜瓜果肉中蔗糖積累起到了重要調控作用。鄧冠聰[11]基于薄皮和厚皮甜瓜材料為雙親構建的重組自交系群體在春秋兩季各定位到3個QTL，分別位于Chr_7、Chr_10 和 Chr_11 和 Chr_4、Chr_5 和 Chr_10 上。Elad Oren 等[12]綜合前人研究結果認為蔗糖代謝和積累的遺傳是復雜的，可能是受多個微效QTL控制的，而不是主基因的變異?！颈狙芯壳腥朦c】目前，對調控甜瓜果實可溶性糖積累的關鍵基因還知之甚少。甜瓜可溶性糖含量是復雜的數量性狀，受環境因素等影響較大。截至目前，雖在多個染色體上發現控制甜瓜果肉蔗糖含量的QTL，但挖掘到功能基因的研究鮮有報道，有關甜瓜可溶性糖含量QTL定位和基因挖掘的研究進展緩慢，限制了利用分子手段對該性狀進行遺傳改良。厚皮甜瓜果肉較厚，一般心部果肉含糖量與邊部果肉具有明顯差異，可能存在不同的調控機制，需逐步深入研究?！緮M解決的關鍵問題】以高糖材料VZX(V醉仙)和低糖材料HP(高代自交系)為雙親，構建F2群體，利用高效液相色譜儀測定成熟果實赤道位置心部果肉蔗糖含量，挑選出蔗糖含量極端材料混池并聯合雙親進行重測序，分析與厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量相關的主效QTL，并結合生物信息學分析，挖掘關鍵候選基因，為利用分子手段培育高蔗糖含量的厚皮甜瓜新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料均由新疆農業科學院哈密瓜研究中心提供。以高糖材料VZX(V醉仙)和低糖材料HP(高代自交系)為雙親雜交獲得F1，再自交1代獲得F2種子。將雙親及F2群體于2020年3月2日育苗，3月20日移栽，種植于新疆農業科學院哈密瓜研究中心吐魯番農科所基地。雙親各種植20株，F2群體共種植200株，吊蔓生長，單蔓整枝，每株留1果，坐果節位在8～10節，種植模式及水肥管理均一致。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集及蔗糖含量

于果實成熟期，利用打孔器在每個果實赤道位置選取3個點采集圓柱狀果肉，去除黏連的胎座，切取近種腔端1/3的果肉作為心部果肉，將3個取樣點樣品混合存放于凍存管中，置于液氮速凍，待萃取蔗糖。

蔗糖萃取及測定均參照楊永等[1]和朱勇等[13]提供的方法。

1.2.2 極端混池(BSA)及QTL定位

在幼果期，采集幼嫩葉片于凍存管中，液氮運回實驗室，-80℃超低溫冰箱保存，待CTAB法提取DNA。利用高效液相色譜儀測定F2群體心部果肉蔗糖含量后，將20株蔗糖含量極端高和20株蔗糖含量極端低的材料DNA分別提取，并等量混合，構建高蔗糖池和低蔗糖池。將2個混池和雙親DNA通過片段化試劑盒打斷成長度為400 bp的片段進行文庫制備，以Novaseq 6000測序平臺 PE150測序模式進行全基因組重測序。對原始數據質控后獲得的clean data與伽師瓜參考基因組進行比對(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/ GCA_009760825.1)，并根據比對結果進行SNP的檢測和注釋。計算混池之間基因型頻率的顯著差異，用SNP-index統計，標記SNP與性狀關聯度越強，SNP-index越接近于1，進而對目標性狀區域定位；基于歐式距離(Euclidean Distance，ED)算法，利用混池間基因型存在差異的SNP位點，統計各個堿基在不同混池中的深度，并計算每個位點ED值，與目標性狀相關聯的基因所在的區域ED值會顯著高于閾值。

基于SNP-index統計和歐式距離(Euclidean Distance，ED)算法計算混池間存在顯著基因型頻率差異的SNP位點，并與心部果肉蔗糖含量性狀進行關聯分析，ΔSNP-index 和ED值高于閾值的位點區域，被認為與目標性狀緊密相關。研究將原始ED值的 2 次方作為關聯值，然后采用局部線性回歸 LOESS方法對ED值進行擬合，以消除背景噪音的影響。

杭州聯川生物技術股份有限公司提供技術支持。

1.2.3 候選基因

基于參考基因組信息，挑選出BSA定位區間中的基因，利用GO富集分析和KEGG通路分析，挖掘潛在的與蔗糖含量相關的候選基因，并通過轉錄組數據(測定了VZX和HP授粉后20 d、30 d和40 d心部果肉轉錄組；由上海美吉生物醫藥科技有限公司提供技術支持)進行驗證，利用IGV2.9.4軟件對候選基因在雙親間的差異位點進行分析，為分子標記的開發及應用奠定基礎。

2 結果與分析

2.1 雙親及F2群體心部果肉蔗糖含量表型分析

研究表明，高糖親本VZX(V醉仙)心部果肉蔗糖含量為72.54 mg/g，而低糖親本HP(高代自交系)心部果肉蔗糖含量為46.66 mg/g，兩者之間具有極顯著差異，平均相差25.88 mg/g。F2群體心部果肉蔗糖含量最低為2.2 mg/g，含量最高可達79.85 mg/g，平均為43.64 mg/g，差異較大，呈連續分布的特點。F2群體心部果肉蔗糖含量頻次分布近似呈正太分布，符合數量性狀的基本特征，可用于蔗糖含量性狀BSA定位分析。圖1,圖2

圖1 雙親心部果肉蔗糖含量差異Fig.1 Difference of sucrose content in center flesh of parents

圖2 F2群體心部果肉蔗糖含量頻次分布Fig.2 Frequency distribution of sucrose content among the F2 population

2.2 極端群體混池的構建及測序

研究表明，從F2群體中選擇心部果肉蔗糖含量極端高和極端低單株各20個構建高蔗糖池和低蔗糖池，聯同雙親進行全基因組重測序，獲得有效測序數據共32.62 G，雙親及兩個混池有效數據平均為8.16G，Q20在95%以上，Q30在89%以上，GC含量在36.16%～44.01%，比對到參考基因組上的總reads數目比例在98.72%～99.02%，平均覆蓋深度為17.76。測序數據質量合格，與選擇的參考基因組比對效率高，能夠滿足后續變異SNP位點的檢測和心部果肉蔗糖含量的QTL定位。表1

表1 測序數據質量Table 1 Quality statistics of sequence data

2.3 厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量的QTL定位

研究表明，雙親及兩個混池共檢測到5 627 028個SNP變異位點，子代混池SNP位點數、轉換類型SNP位點數、顛換類型的SNP位點數、轉換顛換比均明顯高于雙親；子代混池雜合SNP位點數明顯高于純合位點數，高蔗糖池和低蔗糖池雜合比分別為67.74%和69.03%，雙親雜合SNP位點數明顯低于純合位點數，高蔗糖親本VZX和低蔗糖親本HP雜合比分別為26.58%和23.09%。表2

表2 SNP變異位點統計Table 2 Statistics of SNP polymorphism site

基于ΔSNP-index和歐式距離均定位到8號染色體上18 980 000 ～22 270 000 bp共計3.29 Mb的區間。圖3、圖4

圖3 基于SNP-index對厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量的QTL定位Fig. 3 QTL mapping of sucrose content in center flesh of muskmelon based on SNP-index

圖4 基于歐式距離對厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量的QTL定位Fig.4 QTL mapping of sucrose content in center flesh of muskmelon based on Euclidean distance

2.4 厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量相關候選基因

研究表明，8號染色體上3.29 Mb區間共注釋到108個基因，在GO、KEGG、SwissProt、NOG等數據庫分別注釋到88個、40個、72個和101個。71個基因參與生物學合成過程，133個基因參與細胞組分，17個基因參與分子功能；KEGG通路分析表明，參與有機體系統的基因有3個，參與代謝的基因有32個，參與遺傳信息傳遞的基因有14個，參與環境信息傳遞的基因有6個，參與細胞過程的基因有1個。值得特別關注的是GO富集分析參與分子功能的部分，有4個基因(EVM0001419、EVM0004758、EVM0005074和EVM0013242)具有β-半乳糖苷酶活性，但進一步通過轉錄組數據發現4個基因在VZX和HP兩份親本材料果實發育過程中表達量均比較低，且差異較小，初定位區間中注釋到的4個β-半乳糖苷酶基因很可能不是造成雙親蔗糖積累差異的關鍵基因；KEGG通路分析中顯示參與碳水化合物代謝的基因有7個，除4個β-半乳糖苷酶基因外，還有三個基因分別為EVM0000647、EVM0008701和EVM0019814，其中EVM0008701和EVM0019814表達量相對較低，且雙親間差異不明顯，而EVM0000647基因表達量較高，且雙親間具有明顯差異。進一步分析發現，EVM0000647基因參與糖酵解和糖異生的代謝通路。在IGV軟件上，顯示為彩色的位置均表示與參考基因組堿基不同，該基因有8個內含子和9個外顯子組成，僅在第8個外顯子上存在一個同義突變(GTT/GTC)，均編碼纈氨酸，其它外顯子均無有差異的SNP位點，該基因并非通過蛋白質序列差異影響蔗糖的積累，很可能通過基因表達量的差異，造成不同材料果實蔗糖積累的不同。雙親間在該基因啟動子區域存在大量的變異位點。表3，表4，圖5～7

表3 候選區間不同數據庫注釋基因數量Table 3 Number of annotated genes in different databases in the candidate interval

圖6 KEGG通路分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of candidate genes

注：A：基因EVM值0000647基本結構及雙親差異位點；B：雙親在基因EVM值0000647第8個外顯子上的SNP差異位點；C：基因EVM值0000647在雙親間的差異表達

表4 與糖代謝相關的候選基因Table 4 Candidate genes involved in sugar metabolism

3 討 論

新疆甜瓜地方品種資源果實含糖量，是最為迫切需要改良的性狀之一[14, 15]。121份新疆農家品種資源可溶性固形物含量最低為5%，最高達18%，具有廣泛的遺傳變異[15]?？扇苄怨绦挝锖渴枪麑嵖扇苄蕴呛康拈g接反應，甜瓜果實中可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖和果糖，其中蔗糖含量一般為最主要的糖組分[3, 4, 9]。研究選擇高糖材料VZX和低糖材料HP作為雙親構建了F2群體，并利用液相色譜儀測定了雙親及F2群體心部果肉蔗糖含量，顯示雙親間具有極顯著差異，F2群體內蔗糖含量最低為2.20 mg/g，最高可達79.85 mg/g，差異明顯，其蔗糖含量分布基本呈正太分布，符合典型的數量性狀遺傳特征。張寧等[8]構建的F2群體中蔗糖含量最低為1.514 mg/g，最高為67.25 mg/g，與研究中F2群體表型測定結果類似。

極端混池測序(Bulked segregant analysis，簡稱BSA)是一種快速、簡便有效、低成本的數量性狀位點定位方法[16]。研究利用F2群體，構建了極端混池結合全基因組重測序對厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量進行了定位，在8號染色體上定位到一個大小為3.29 Mb的QTL位點。Harel-Beja等[9]利用PI414723和Dulce為雙親衍生的重組自交系群體，構建了一個包含668個DNA標記的遺傳連鎖圖譜，2006年在LG2、LG3、LG5和LG8連鎖群上共定位到與蔗糖含量相關的QTL位點6個，而2007年僅在LG3上定位到1個QTL位點，其中2006年8號連鎖群上定位到的QTL可解釋18.3%的表型遺傳變異。張寧等[8]利用F2群體構建了SSR標記的遺傳連鎖圖譜，在3號和4號連鎖群上分別定位到與總糖和果糖含量相關的QTL位點各1個，未定位到與蔗糖相關的QTL。Argyris等[10]基于近等基因系群體，在2、3、4、5、7、8和11號染色體上共定位到11個與蔗糖含量相關的QTL；基于F2、BC1、BC2和IL等群體，在4、5和10號染色體上共定位到6個與蔗糖含量相關的QTL；在5號染色體上存在一個穩定的QTL即sucqsc5.1。綜上可見，甜瓜果實蔗糖含量性狀為多基因控制的復雜數量性狀[10]，在一定程度上阻礙了包括蔗糖在內的甜瓜果肉可溶性糖含量性狀的QTL定位及功能基因挖掘。蔗糖含量表型的準確鑒定是影響其QTL定位的又一主要因素。蔗糖在果實發育前期基本無積累，在果實發育后期蔗糖積累迅速增加[1]，果實完全成熟是影響蔗糖含量表型準確鑒定的關鍵；受栽培環境及管理措施的影響，植株的生長狀況也會影響蔗糖含量表型的鑒定；蔗糖含量的準確測定一般需要利用高效液相色譜的方法，除遺傳群體的種植管理外，還涉及到樣品采集、可溶性糖萃取、測定等環節，限制了用于QTL定位的群體規模。

研究在3.29 Mb的定位區間內，利用伽師瓜參考基因組(HTTPS://WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV/ASSEMBLY/GCA_009760825.1)共注釋到108個基因。通過GO富集分析和KEGG通路分析，進一步聚焦到碳水化合物代謝通路上的7個基因，其中4個推測為β-半乳糖苷酶基因，但雙親不同果實發育時期的轉錄組數據顯示，4個β-半乳糖苷酶基因在果實發育過程中基因表達量都非常低。Ren Yi 等[17]發現β-半乳糖苷酶基因在西瓜果實發育過程中表達量也非常低，而高表達的α-半乳糖甘酶ClAGA2基因被認為是西瓜果實蔗糖積累過程中的關鍵節點基因，同源比對甜瓜上的α-半乳糖甘酶基因也位于8號染色體，但并未在研究定位區間內，可能甜瓜和西瓜在蔗糖積累的分子調控上是存在一定差異的。蔗糖積累在甜瓜果實幼果期和成熟期有著明顯的差異，幼果期可溶性糖主要被用于果實生長發育和提供能量，成熟期果實停止生長，主要以蔗糖的形式貯存起來[3]。在之前的研究中也發現[1]，蔗糖積累的起始時間可能是造成不同材料間蔗糖含量差異的重要原因，MELO3C014519 基因被認為可能是通過其高表達延長了果實生長過程，而阻礙了蔗糖的積累，造成了雙親材料蔗糖含量的差異[10]。研究中參與碳水化合物代謝的另外3個基因(EVM0000647、EVM0008701和EVM0019814)，EVM0008701和EVM0019814在VZX和HP兩份材料果實發育過程中表達量相對較低，且差異不明顯，而EVM0000647基因表達量較高，參與糖酵解和糖異生的生化過程，且雙親間具有明顯差異，該基因在低糖親本HP的表達量在果實3個不同發育時期均明顯高于高糖親本VZX。VZX和HP在該基因編碼區僅存在一個同義突變，但在啟動子區域存在大量的差異位點，該基因可能也通過表達量的差異負向調控厚皮甜瓜心部果肉蔗糖的積累，但還有待于進一步通過基因編輯等方法驗證該基因的功能。

4 結 論

利用VZX和HP為雙親及其衍生的F2群體，在8號染色體上定位到1個影響厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量的QTL，大小為3.29 Mb；在參考基因組上共注釋到108個基因，并結合轉錄組數據在初定位區間內獲得一個參與糖酵解和糖異生生化過程、高表達且表達量在雙親間具有明顯差異的候選基因EVM0000647；該基因可能通過表達量的差異負向調控厚皮甜瓜心部果肉蔗糖的積累。