香梨黑斑病病原菌分離及拮抗菌篩選鑒定

魯晏宏，郝金輝，詹發強，王 寧，侯新強，楊 蓉，包慧芳，龍宣杞

(1.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046；2 .新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】庫爾勒香梨味甜爽滑、香氣濃郁、皮薄肉細等特點[1]。香梨貯藏過程中需要VC、糖分等來維持采后的生命活動，導致其防御能力降低，在運輸及貯藏過程中容易發生腐爛現象，黑斑病即為香梨高發的采后病害之一。香梨受到黑斑病為享，導致香梨爛果、掉果[2]。香梨是新疆優勢特色農產品，從香梨樹體中篩選對香梨黑斑病病原菌有拮抗作用的內生菌，對庫爾勒香梨采后生物保鮮具有重大意義?！厩叭搜芯窟M展】植物內生菌是指生活在植物組織內部，不會對植物組織造成病癥的微生物[3, 4]。植物內生菌多種多樣且普遍存在。植物內生菌與植物是互惠的共生關系，內生菌可利用宿主營養進行生長代謝，反之，內生菌可通過信號傳導或自身的代謝產物影響宿主的生長發育等[5-8]。內生菌的代謝產物具有抗氧化效果甚至可以影響果蔬防御酶的活性。隆麗林等[9]研究發現，虎杖內生菌發酵液具有延長草莓貯藏期的作用；金衛華等[10]研究發現櫻樹內生菌代謝產物具有抗氧化的活性；徐良雄等[11]發現植物內生真菌PeziculaneosporulosaSC1337具有良好的水果防腐保鮮效果?！颈狙芯壳腥朦c】目前有關香梨黑斑病病原菌分離及拮抗菌篩選鑒定文獻較少，需篩選對香梨黑斑病菌有拮抗作用的內生菌，研究庫爾勒香梨采后生防保鮮技術?！緮M解決的關鍵問題】研究從香梨樹體中篩選出對采后黑斑病病原菌具有拮抗作用的內生菌，并對其應用效果進行研究，獲得效果優良的香梨黑斑病生物保鮮菌種，為香梨采后保鮮提供重要的理論參考和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 香梨樹組織

庫爾勒香梨葉片、庫爾勒香梨樹枝條，采摘于新疆庫爾勒梨園。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：馬鈴薯浸出粉6 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L。

馬鈴薯葡萄糖水培養基(PDB)：馬鈴薯浸出粉6 g/L，葡萄糖20 g/L。

營養瓊脂(NA)培養基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉 3 g/L,氯化鈉5 g/L，瓊脂粉15 g/L。

營養肉湯(NB)培養基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉 3 g/L,氯化鈉5 g/L調整pH值至7.2左右。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離、純化及鑒定

1.2.1.1 病原菌分離、純化

以常規組織分離法對感病香梨果實進行病原菌分離純化[12-13]，挑選有黑斑病癥狀的香梨果實50個以上，75%酒精消毒30s，無菌水沖洗5次，用1%次氯酸鈉消毒1min，無菌水沖洗5次，切取病鍵交界處果肉置于PDA培養基于28℃恒溫箱培養2～3 d。挑取長出的真菌菌絲邊緣接種至新PDA平板純化培養，多次轉接至菌絲狀態一致，將純化后的菌株轉接至PDA斜面，于4℃保存備用。

1.2.1.2 病原菌的分子生物學鑒定

采用美國Zymo Research 公司Fungal/Bacterial DNA MiniprepTM D6005試劑盒提取真菌基因組。以基因組DNA為模板，ITS基因ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)為引物[14-15]，進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL：2×Mix 25 μL，ITS1 (10 μM) 1 μL，ITS4(10 μM)1 μL，DNA模版 1 μL，ddH2O加至50 μL。PCR反應條件為：預變性94℃ 5 min；35個循環包括：變性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s，延伸72℃ 50 s；延伸72℃ 10 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產物送至北京鼎國昌盛生物技術有限公司進行測序。

1.2.2 拮抗菌分離、純化

采摘新鮮的梨樹葉片和梨樹枝條，75%酒精消毒1 min，無菌水沖洗3～5次，1%次氯酸鈉消毒3 min，無菌水沖洗3～5次，取最后1次沖洗無菌水涂板作為對照組。用無菌剪刀將消毒處理后的葉片/枝條剪碎，采用無菌研缽充分研磨，研磨過程中分批次共加入5 mL無菌水[10，16]。分別吸取200 μL研磨液分別涂布于NA上，置于28℃恒溫箱培養5～7 d。挑取單菌落轉接至新平板純化培養，多次轉接至菌落形態一致，將純化后的菌落轉接至NA斜面，于4℃保存備用。

1.2.3 拮抗菌篩選

1.2.3.1 拮抗菌初篩

采用平板對峙法，每個培養皿傾倒25mL PDA培養基，備用。用無菌打孔器、鑷子將活化的病原菌菌餅置于PDA平板中央[17-18]，在菌餅周圍均勻接種4株拮抗菌，每株菌重復接種3塊平板，置于28℃恒溫箱培養3～5 d，觀察內生菌對病原菌的抑制作用。

1.2.3.2 拮抗菌復篩

采用牛津杯瓊脂擴散法測定發酵液的抑菌性[17-18]，對拮抗菌的抑菌效果進行復篩。每個培養皿傾倒25 mL PDA培養基，備用。挑取拮抗菌單菌落接入50 mL NB液體培養基，于28℃ 160 r/min恒溫搖床培養12 h后，調整發酵液至最低OD600值為0.473左右，取1 mL發酵液于離心機12 000 r/min 離心25 min，備用。挑取病原菌菌絲接種至PDB液體培養基，于28℃ 160 r/min恒溫搖床培養20 h后，備用。吸取200 μl病原菌菌液涂布于PDA平板上，在PDA平板上放置兩個牛津杯，吸取200 μL上清液添加于牛津杯中，于28℃恒溫培養箱中培養3～5 d，觀察抑菌效果。

1.2.4 拮抗菌的分子生物學鑒定

采用美國Zymo Research 公司Fungal/Bacterial DNA MiniprepTM D6005試劑盒提取提取拮抗菌基因組DNA。用細菌通用引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)，以PCR反應體系為50 μL：2×Mix 25 μL,27F(10 μM) 1 μL,1 492R(10 μM) 1 μL,模版1 μL，ddH2O 22 μL[21-22]。PCR反應條件為：預變性94℃ 5 min；35個循環包括：變性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s，延伸72℃ 1 min 30 s；延伸72℃ 10 min。對PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產物送至北京鼎國昌盛生物技術有限公司進行測序。

1.2.5 拮抗菌抑菌效果測定

1.2.5.1 有損傷法接種拮抗菌

選取復篩抑菌效果較好的拮抗菌，挑取單菌落接種至100 mL 相應液體培養基，于28℃ 160r/min培養16 h備用。將香梨洗凈晾干后，用1%次氯酸鈉消毒1 min，晾干。在香梨上打3個直徑6 mm深5 mm孔，分別添加3 μL拮抗菌菌液(CK1)；3 μL病原菌菌液(CK2)；3 μL拮抗菌菌液+3 μL病原菌懸液(CL)[23]。觀察果實發病狀況，統計果實發病后病斑直徑并根據如下公式計算抑菌率。

1.2.5.2 無損傷法接種拮抗菌

挑取拮抗菌單菌落接種于100 mL NB液體培養基于28℃ 160 r/min培養14 h后備用。將香梨果實洗凈晾干后，用1%次氯酸鈉進行30 s消毒處理，晾干后，浸沒于100 mL拮抗菌發酵液中3 min，取出室溫25℃放置24 h。將無菌牙簽浸沒于病原菌菌懸液10 s，在果實上采用針刺接種法接種病原菌，置于室溫放置。有發病癥狀開始統計病斑直徑。

抑菌率(%)=

1.3 數據處理

采用MEGA7.0軟件構建菌種系統發育樹，采用office 2019 excel進行圖表繪制，采用SPSS中one-way ANOVA中的Duncan法對數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定

2.1.1 病原菌的分離純化

研究表明，從50個香梨果實上分到的病原菌從外部形態大致分3類，一類顏色為白色，結構干燥蓬松，正面呈雪白色，分離率為6%，命名為XL1；一類菌株正反面均為黑色，生長后期菌株上出現白色菌絲，分離率為86%，命名為XL2；一類菌株生長初期為白色，后期菌落逐漸轉變為青色，分離率為8%，命名為XL3。 圖1

注：(a)XL1病原菌菌株平板內形態為(b)XL2病原菌菌株平板內形態(c)XL2回接發病圖(d)XL2感染病原菌香梨縱切圖(e)XL3病原菌菌株平板內形態為(f)XL3回接發病圖 (g)XL3感染病原菌香梨縱切圖

2.1.2 病原菌的分子生物學鑒定

研究表明，XL1為鐮孢菌；XL2與鏈格孢AlternatiaalternataZTCA11基因同源性高達99%，XL2為香梨黑斑病病原菌與目前已有梨黑斑病報道病原菌菌株一致，因后續實驗以XL2為靶標菌株進行拮抗菌篩選。XL3與擴展青霉PenicilliumexpansumFP2基因同源性高達98%，XL3為擴展青霉。 圖2，圖3

圖2 XL2基于rDNA-ITS基因序列的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of strain XL2 based on ITS gene sequences

注：分支上的數字為Bootstrap值，表示構建系統進化樹時計算1000次時形成該節點的百分比，只顯示大于50%的的值；括號內數值為GenBank登錄號；標尺0.1代表10%的16S r RNA基因序列的進化差異。

2.2 拮抗菌的篩選

研究表明，篩選出具有拮抗香梨黑斑病的菌株8株，分別為NY1、NY2、NY5、NY7、NY9、NY10、NY11、NY15，其中NY2、NY7、NY15對病原菌有較好

的抑制效果，抑菌圈直徑均可達20 mm以上。其次抑菌效果較好的為NY5、NY11，抑菌圈直徑可達14 mm以上。表1，圖4

表1 拮抗菌發酵液對鏈格孢抑菌效果Table1 Oxford cup AGAR diffusion inhibition results

圖4 拮抗菌對XL2抑菌作用Fig.4 Antagonistic activity of antagonist against XL2

2.3 拮抗菌的分子生物學鑒定

研究表明，8株拮抗菌均為芽孢桿菌屬，BacillusparalicheniformisNY1、BacillusvelezensisNY2、NY5、NY7、NY9、NY15、BacillussiamensisNY11和BacillustequilensisNY10。圖5，圖6

圖5 拮抗菌基于16s rRNA基因序列的PCR擴增Fig.5 PCR amplification of antagonistic bacteria based on 16S rRNA gene sequences

注：分支上的數字為Bootstrap值，表示構建系統進化樹時計算1000次時形成該節點的百分比，只顯示大于50%的的值；括號內數值為GenBank登錄號；標尺0.1代表10%的16S r RNA基因序列的進化差異。

2.4 庫爾勒香梨黑斑病抑菌試驗

2.4.1 損傷接種拮抗菌

研究表明，4 d時，離體果實開始出現發病癥狀，統計5 d時病斑直徑，并以此計算抑菌率。其中抑菌效果最好的為NY2、NY15可達30%以上，其次為NY11，抑菌率可達20%以上。僅接種拮抗菌發酵液CK1，表面未出現發病癥狀；CK2僅接種病原菌，病原菌病斑平均值可達20 mm以上。表2

表2 發酵液在庫爾勒香梨對病原菌抑制率Table 2 Inhibitory rate of pathogenic bacteria in Korla fragrant pear

2.4.2 無損傷接種拮抗菌

研究表明，NY2在4 d時抑菌效果最佳，抑菌率可達到80%以上，NY11在4 d時抑菌率低于NY2、NY15，但在接種5～7d時，抑菌效果最佳。6d時，NY11防效達到27%，優于NY2和NY5的防效。 圖7

注：標有*表示與其余組差異顯著(P<0.05)

3 討 論

研究僅從梨樹中篩得16株內生菌，且其中有拮抗效果的內生菌均鑒定為芽孢桿菌，實驗中分離得到的內生菌不夠豐富，是由于盡管實驗所使用的分離方法在分離具有一定功能的目標微生物方面被廣泛應用，但絕大部分菌株仍是較難培養的，被鑒定分離的菌株僅為其總數的1%～10%[24]。研究分離出的拮抗內生菌經過16S rRNA基因序列分析，均為芽孢桿菌屬，分別為BacillusparalicheniformisNY1、BacillusvelezensisNY2、NY5、NY7、NY9、NY15、BacillussiamensisNY11和BacillustequilensisNY10。研究從新疆庫爾勒香梨梨樹中篩選獲得的NY2、NY15貝萊斯芽孢桿菌發酵液能顯著抑制AlternatiaalternataXL2在PDA培養基上的生長。NY2在離體果實抑菌實驗中也有較佳效果，在離體果實實驗無損傷接種中前期(4 d)時，能達到80%以上的抑菌率。實驗中發現，NY11在PDA培養基上抑菌效果并不突出，但在庫爾勒香梨抑菌效果實驗中效果較優，且抑菌效果較為穩定。生防菌產生抑菌效果主要機制一為生態占位二為產生抑菌物質。分析NY2主要依靠分泌抑菌物質拮抗病原菌，所以后期抑菌效果較差；NY11定殖能力較好且主要靠生理占位拮抗病原菌，所以后期抑菌效果優于NY2。NY7在平板對峙中抑菌效果較好，但在香梨上抑菌表現明顯衰減，考慮NY7在香梨上定殖能力較差。無損傷接種拮抗菌由于梨果個體間存在差異，故實驗結果會受到梨果個體抗菌差異的影響。對比NY2、NY11、NY15無損傷接種拮抗菌于有損傷接種拮抗菌5 d時抑菌率，推測NY2、NY11菌株對于果皮滲透性較好，而NY15滲透性可能較差。

但果實采后的生理變化及抗病特性使得生防菌在實際應用中比篩選更為復雜，研究中拮抗菌在PDA培養基上表現出較好的抑菌性，但庫爾勒香梨抑菌實驗中，效果卻減弱。原因可能是：雖然拮抗菌能夠產生能抑制AlternatiaalternataXL2生長的物質，但庫爾勒香梨作為AlternatiaalternataXL2的親和寄主，果肉中的營養可能更適合病原菌萌發生長，使得發酵液對病原菌的抑制作用減弱。后續研究中對已經篩得的拮抗菌進行進一步探索其適宜生長條件及抑菌機理。

4 結 論

分離出1株香梨黑斑病病原菌AlternatiaalternataXL2及16株內生菌，并篩選出8株對AlternatiaalternataXL2具有拮抗作用的梨樹內生菌。研究分離出的8株拮抗內生菌經過16S rRNA基因序列分析鑒定均屬于芽孢桿菌，分別為BacillusparalicheniformisNY1、BacillusvelezensisNY2、NY5、NY7、NY9、NY15、BacillussiamensisNY11和BacillustequilensisNY10。其中NY2、NY7發酵液對AlternatiaalternataXL2在PDA培養基上的生長抑制較佳，其次為NY7。NY2、NY11、NY15抑菌效果較佳。NY2在離體果實實驗無損傷接種中前期(4 d)時，能達到80%以上的抑菌率，但NY11在長期抑菌防效中防效較佳。