水稻苗期耐冷種質資源篩選及耐冷性綜合評價

程 露 項 陽 逄洪波,* 職銘陽 趙宗耀 金 明 陳 強 鄭曉明

(1.沈陽師范大學 生命科學學院,沈陽 110034;2.沈陽師范大學 實驗教學中心,沈陽 110034;3.中國農業科學院 作物科學研究所,北京 100081)

水稻是亞洲人口的主糧之一[1-2]，在全球的糧食安全中占有重要地位。我國是水稻大國，據統計，約90%的世界水稻種植和產量均集中在亞洲，其中我國水稻產量約占世界總產量的45%。但水稻屬喜溫作物，其生長發育的各個階段均易受到冷害威脅[3-4]。在我國，平均每4～5年就會發生一次大面積冷害，引起水稻大幅度減產甚至絕收[5-6]。故研究水稻耐冷機理、建立方便、精準的耐冷評價體系對于水稻耐冷品種的選育具有十分重要的意義。

近年來，研究人員已經針對水稻苗期耐冷種質資源的篩選做了很多工作。商水根等[7]以苗期存活率為評價指標，從1 542 份核心種質資源中篩選出73 份耐冷性較強的材料；肖宇龍等[8]以苗期葉片的赤枯度作為耐冷性評價指標，從江西省23份早稻中篩選出8 份耐冷性較強的材料；蔡志歡等[9]以死苗率作為評價指標，從230份水稻種質資源中篩選出19份耐冷性較強的材料；王代鑫等[10]以抗壞血酸過氧化物酶活性等4個生理指標為評價指標，從吉林省21份晚熟水稻苗期種質資源中篩選出5份耐冷性較強的材料。這些研究結果表明，苗期葉片的赤枯度、存活率和死亡率等一系列生理指標均可用于苗期耐冷性評價。但耐冷性屬于多個因素共同決定的數量性狀，僅用某一個或幾個評價指標具有一定的局限性，不能精準地鑒定出水稻的苗期耐冷性。故應同時采用形態學指標黃葉率和6個光合生理指標，分別是初始熒光(Fo)、最大熒光產量(Fm)、PSⅡ潛在活性(Fv/Fo)、原初光能轉換效率(Fv/Fm)、葉綠素含量(SPAD)、葉片性能(PI)，以期對水稻苗期耐冷性進行精準鑒定評價。

主成分分析是一種可將多個變量轉化為少數幾個綜合指標(即主成分)的多元統計方法。每個綜合指標可涵蓋原始變量的絕大部分信息，有效避免了指標間存在的信息重疊[11]，經常與相關性分析、隸屬函數法和回歸分析等多種統計方法結合使用，目前已應用在水稻和小麥等多種農作物的耐鹽和耐旱等抗逆性綜合評價中[12-15]。如馬帥國等[16]以165份粳稻為材料，以苗高、根長和SPAD值等12個形態學性狀作為評價指標，通過主成分分析法、聚類分析和逐步回歸分析對苗期耐鹽性進行綜合評價，篩選出5份耐鹽性較強的材料；袁杰等[17]以株高、根長和苗鮮重等6個形態學性狀作為評價指標，通過相關性分析和主成分分析結合隸屬函數法對42份水稻苗期耐鹽性進行綜合評價，篩選出5份耐鹽性較強的材料；孔憲旺等[18]以20份優異水稻種質資源為材料，以苗高、根長和莖葉鮮重等9個形態學性狀為評價指標，通過差異性顯著分析等統計學方法，綜合評價了苗期耐旱性，篩選出3份耐旱性較強的材料。目前，已對作物的一些抗逆性，如耐鹽和耐旱等進行了綜合評價，而對水稻苗期耐冷性的綜合評價鮮見報道。本研究以52份水稻種質資源作為研究對象，采用人工低溫脅迫法，測定其形態學指標黃葉率和6個光合生理指標，應用主成分分析、隸屬函數法、聚類分析和回歸分析等多種統計方法，對水稻苗期耐冷性進行綜合鑒定評價，旨在建立更加精準的耐冷性綜合評價體系，以期為培育苗期耐冷品種提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所選用的52份水稻種質資源由中國農業科學院作物科學研究所提供，分別來自中國、菲律賓、馬來西亞、斯里蘭卡及日本5個國家。具體品種信息，見表1。

表1 用于本試驗水稻品種詳細信息Table 1 Details of rice varieties used in this study

表1(續)

1.2 幼苗培養

種子置于50 ℃ 72 h打破休眠后，光照氣候培養箱中培養(30 ℃，光照 12 h/黑暗 12 h，光強12 000 lx)至三葉一心后，選取健壯、長勢較一致的3盆苗進行試驗。試驗分為3組，對照組(CK)：放置于人工氣候培養箱(30 ℃，光照 12 h/黑暗 12 h，光強12 000 lx)培養；試驗A組：放置于人工氣候培養箱(10 ℃，光照12 h/黑暗12 h，光強12 000 lx)進行48 h 低溫脅迫后測定生理指標；試驗B組：放置于人工氣候培養箱(4 ℃，光照12 h/黑暗12 h，光強12 000 lx)進行24 h 低溫脅迫后測定黃葉率。

1.3 生理指標的測定

參考Zhao等[19]的研究，選取低溫脅迫前與低溫脅迫后2個時間點進行葉綠素含量和葉綠素熒光參數測定，測定位置選取水稻第二葉的中上部，進行3次生物學重復取平均值。

1.3.1葉綠素含量的測定

采用SPAD-502 Plus葉綠素儀(浙江托普儀器公司)進行測定。

1.3.2葉綠素熒光參數的測定

使用英國 Hansatech 公司的pocket PEA 便攜式熒光儀測定Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm和PI指標。測定前水稻葉片進行暗適應30 min。

1.4 形態指標的測定

測定4 ℃低溫脅迫24 h后幼苗黃葉的數量，葉片發黃超過一半以上則記為黃葉，3次生物學重復。

1.5 數據處理

使用Excel 2010計算原始數據均值，利用SPSS 26.0軟件進行相關性分析、主成分分析、聚類分析以及逐步回歸分析，相關指標計算公式和方法參考付麗君等[20]的方法。

1.5.1耐冷系數

對于所測得的原始數據進行處理，對照組所測3次生物學重復進行平均值計算，取其平均值；處理組同對照組，取其平均值。

(1)

式中：CTC為52個水稻品種其7個單項指標的耐冷系數，T為試驗組中各單項指標低溫脅迫后3次測定值的平均值，CK為對照組中各單項指標30 ℃ 3次測定值的平均值。

1.5.2綜合指標隸屬函數值(U(Xj))

(2)

式中：Xj、Xmin和Xmax依次表示每個試驗材料中第j個綜合指標值、最小值和最大值。

1.5.3權重(Wj)

(3)

式中：Pj為所有試驗材料第j個綜合指標的貢獻率。

1.5.4耐冷性綜合評價值(D)

(4)

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下各指標的相關性分析

由表2可知，在低溫脅迫下52份水稻種質資源6個光合生理指標與形態學指標黃葉率之間均呈負相關關系，其中Fo、Fv/Fo、SPAD與黃葉率呈顯著負相關，Fm與黃葉綠呈極顯著負相關，且相關系數最大，達到-0.416；Fm與Fo、Fv/Fo、Fv/Fm、PI及黃葉率之間均呈極顯著正相關，其中與Fv/Fm之間的相關系數最大，為0.823。此外，這些指標之間均呈顯著相關關系，導致信息重疊，無法通過這些指標準確的鑒定出水稻的苗期耐冷性，故本研究通過主成分分析法對水稻的耐冷性進行綜合評價。

表2 低溫脅迫下水稻苗期各指標的相關系數矩陣Table 2 Correlation coefficient matrix of rice seedling indicators under low temperature stress

2.2 主成分分析

由表3可知，主成分1、2、3的特征值依次為3.338、1.602和0.939，均>0.90，且前3個主成分的貢獻率分別是47.686%、22.892%和13.412%，累計貢獻率高達83.991%，包含了絕大多數信息。因此，本研究選取前3個主成分(CI1、CI2和CI3)，即將最初的7個指標轉換成3個相對獨立的綜合指標對苗期耐冷性進行綜合評價。

表3 各綜合指標的特征值及貢獻率Table 3 Characteristic value and contribution rate of each comprehensive index

由表4可知，在主成分1(CI1)中，Fm、Fv/Fo和Fv/Fm為主要作用因子，其因子載荷分別為0.917、0.940、和0.899；主成分2(CI2)中，Fo、SPAD和黃葉率為主要作用因子，其因子載荷分別為0.743、0.720 和-0.533；而主成分3(CI3)中，Fo、SPAD和PI為主要作用因子，其因子載荷分別為0.492、-0.477 和-0.451。

表4 各綜合指標值的因子載荷矩陣Table 4 Factor loading matrix of each comprehensive index value

2.3 水稻苗期耐冷性綜合評價

由表5可知，對于同一個綜合指標CI1而言，‘東農4號’在10 ℃低溫脅迫下的綜合指標值(CI1)最大，達到3.598，且對應的隸屬函數值U1=1，說明如果將主成分1作為苗期耐冷性評價指標，‘東農4號’品種的耐冷性最強；而‘IRIS 313-15901’CI1值最小，且U1值為0，說明其耐冷性最差。根據各綜合指標的貢獻率結合公式(3)，求出3個綜合指標權重W分別為0.568、0.273和0.160，說明主成分1所占的權重較大。根據公式(4)，求出各品種的耐冷性綜合評價值(D)(表5)，且D與耐冷性成顯著正相關。

表5 低溫脅迫下52個水稻品種的綜合指標值(CI)及其權重(W)、隸屬函數值(U)、耐冷性評價值(D)及排序Table 5 Comprehensive index value (CI)and its weight (W),membership function value (U),cold tolerance evaluation (D)and ranking of 52 rice varieties under low temperature stress

表5(續)

表5(續)

2.4 聚類分析

根據D，將52份水稻品種進行耐冷性劃分為5類，見圖1，分別為極強耐冷、強耐冷、中耐冷，弱耐冷及冷敏感。極強耐冷組中是‘合江4號’、‘津原85’和‘東農4號’3份材料；強耐冷分組中有16份材料，分別是‘北稻1號’、‘特青’、‘勝優2號’、‘鎮稻2號’、‘京稻21’、‘京花103’、‘富禾99’、‘南粳37’、‘特三矮2’、‘元豐6號’、‘龍粳14’、‘石狩白毛’、‘藤系138’、‘五優稻1號’、‘沈農129’和‘開粳2號’；中耐冷組有26個品種，分別是‘雙桂1號’、‘豫秈9號’、‘IRIS 313-11882’、‘IRIS 313-12236’、‘廣場13’、‘IRIS 313-11951’、‘揚稻5號’、‘IRIS 313-11885’、‘中花8號’、‘IRIS 313-11866’、‘IRIS 313-11911’、‘IRIS 313-12273’、‘鹽粳48’、‘鎮秈96’、‘IRIS 313-11929’、‘IRIS 313-12135’、‘IRIS 313-11968’、‘IRIS 313-11986’、‘科砂1號’、‘特優2035’、‘廣場矮3784’、‘IRIS 313-12012’、‘珍珠矮11’、‘BG90-2’、‘IRIS 313-11887’和‘馬來紅’；弱冷寒組有3個品種，分別是‘IRIS 313-11859’、‘臨秈22’和‘IRIS 313-11884’；冷敏感組有4份材料，分別是‘IRIS 313-15901’、‘鎮稻272’、‘瀘紅早1號’和‘秈小占’。

Ⅰ，強耐冷；Ⅱ，極強耐冷；Ⅲ，弱耐冷；Ⅳ，中耐冷；Ⅴ，冷敏感。虛線表示歐式距離2.5。Ⅰ,strong cold tolerance;Ⅱ,extremely strong cold tolerance;Ⅲ,weak cold tolerance;Ⅳ,moderate cold tolerance;Ⅴ,cold sensitivity.The dotted line represents Euclidean distance 2.5.圖1 基于D的52份水稻種質資源的耐寒性聚類分析Fig.1 Cluster analysis of cold tolerance of 52 rice germplasm resources based on D value

2.5 回歸模型建立與苗期耐冷性主要評價指標的篩選

為了進一步確定水稻苗期耐冷性評價指標，以D作為因變量y，7個相關指標作為自變量x，進行了逐步回歸分析，回歸方程如下：

Y=-0.043+0.244X1+0.208X2+0.100X3+
0.152X4+0.123X5-0.016X6-0.110X7。

式中：X1-7依次代表Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、SPAD、PI和黃葉率，方程判定系數R2=1，P=0，7個自變量幾乎可決定D的全部變異，由此可見。這7個單項指標與水稻苗期耐冷性顯著相關，其中Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm和SPAD共5個指標與其耐冷性呈顯著正相關，葉片性能PI和黃葉率與其耐冷性呈顯著負相關，可以作為水稻苗期耐冷性的主要評價指標。

3 討 論

3.1 水稻苗期耐冷指標篩選

植物受逆境脅迫的影響與逆境種類、逆境強度和持續時間等多種因素緊密相連，且與植物種類有關[21-23]。研究表明，低溫脅迫對水稻的外部形態特征和生理生化指標均會產生影響[24-28]。形態學指標是一種直接的診斷工具，可以直接反映植物受低溫損傷的程度[29-30]。相對于形態學指標而言，生理學指標可進一步反映植物在逆境條件下體內各代謝過程的變化[31-32]，水稻在低溫脅迫下會減少葉綠素合成，故葉綠素含量和葉綠素熒光相關的參數通常被作為判斷植物耐受逆境脅迫能力的重要指標[25]。本研究選用形態學指標黃葉率并在此基礎上結合Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、SPAD及PI 6個光合生理指標作為水稻苗期耐寒性的評價指標。

3.2 水稻苗期耐冷性綜合評價

植物耐冷特性是一個由多種因素共同調節的復雜機制[33]，僅用單一的某個指標評價植物的耐冷性具有一定的局限性，可能導致結果出現誤差。多個評價指標可以從不同方面反映出耐冷性，但多個指標間往往存在一定的相關性，數據出現信息重疊，導致難以正確判斷各個指標對于某一性狀的影響。應用主成分分析法，可有效消除各項指標之間的相關性，且指標間相關系數越大，分析效果越好。此外，主成分分析可將多個指標轉換成相對獨立的幾個綜合指標，且按照方差大小依次排序，通常選擇累計貢獻率≥80%的主成分，包含絕大部分原始數據信息。如王麗艷等[34]以11份水稻種質資源的種子萌發和幼苗生長指標為耐冷評價依據，唐雙勤等[35]以供試的41份水稻種質資源芽期的7個單項指標為耐冷評價依據，通過主成分分析、聚類分析并結合隸屬函數值方法對其進行耐冷性綜合評價。目前已有的主成分分析研究中，有關水稻苗期耐冷性的研究相對較少，并且由于生理指標的評定工作量大且繁瑣，因此絕大多數研究均采用形態學指標，只有少數研究采用生理學指標。本研究選用了形態學指標黃葉率，并在此基礎上添加了葉綠素含量和葉綠素熒光參數作為生理指標，以上生理指標可直接通過儀器測定，簡便易行，工作量小。已有研究表明，光合作用可反映植物在逆境條件下自身的生長發育狀態，葉綠素含量和葉綠素熒光參數的大小可作為植物耐受逆境的生理指標[36]。

3.3 不同水稻品種間的耐冷性差異

本試驗基于耐冷性綜合評價值(D)將52份種質資源聚類分為5個耐冷等級。其中極強耐冷品種3個，均屬于粳稻；強耐冷品種共16份，13份是粳稻；弱耐冷的3個品種與冷敏感4個品種均為秈稻。從結果上看，粳稻的耐冷性普遍強于秈稻，這也與以往的研究結果相一致[29,37]。3個極強耐冷品種‘合江4號’、‘東農4號’和‘津原85’是來自黑龍江省和天津市培育成的品種。同時本研究中有3份秈稻屬于強耐冷品種，說明秈稻中也存在較好的耐冷資源，這3份材料是來自廣東省的‘特青’、‘勝優2號’和‘特三矮2’。廣東省位于中國南部，屬亞熱帶和熱帶季風氣候，其北靠南嶺山脈，南臨南海，稻區遼闊，從低海拔的潮田到海拔千米的山區梯田都有水稻種植，且很多地區是雙季稻。且這3個秈稻品種是早秈稻。這也反映出水稻品種的耐冷性不僅僅是由其自身遺傳因素所決定的，還可能與當地種植的習俗有關。

4 結 論

本研究選用形態學性狀指標黃葉率，并在此基礎上結合Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、SPAD及PI等6個光合生理指標，對52份水稻種質資源進行苗期耐冷性鑒定，通過相關性分析，表明低溫脅迫下7個單項指標之間存在不同程度的相關性；通過主成分分析，將7個單項指標轉換成3個相對獨立的綜合指標；并結合隸屬函數法得到各主成分的權重及52個水稻品種耐冷特性的綜合評價值(D)；通過聚類分析將52份水稻種質資源劃分成5個耐冷等級；基于D篩選出3份極強耐冷種質資源，分別為‘東農4號’、‘合江4號’、‘津原85’；通過回歸分析對水稻苗期耐冷性進行預測，其結果與隸屬函數法所得結果相吻合，綜合主成分分析和回歸分析篩選出的這7個指標可以作為鑒定水稻苗期耐冷特性的可靠指標。