新疆動物源糞腸球菌的耐藥性分析與耐藥基因檢測

陳萬昭 陳月月 易海波 秦 蕾 徐琦琦 吳慧敏 夏利寧*

(1.新疆農業大學 動物醫學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆霍城縣職業技術學校，新疆 霍城 835200；3.新疆昭蘇縣喀夏加爾鎮畜牧獸醫站，新疆 昭蘇 835618)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)為革蘭氏陽性菌，在自然界中廣泛存在，是人和部分動物腸道中的常在菌群之一，也是條件致病菌[1]。糞腸球菌可能會引發包括泌尿系統感染、感染性心內膜炎、腦膜炎和菌血癥等多種嚴重疾病[2]。近年來，隨著腸球菌對抗菌藥物耐藥性的增加，導致腸球菌感染治療失敗的病例屢見不鮮[3]，糞腸球菌在人類臨床腸球菌感染分離株中占有重要比例[2]，亦成為全球范圍流行的第三大院內感染病原菌[4]。糞腸球菌耐藥機制復雜，具有顯著的基因組可塑性，利用質粒、轉座子和插入序列高效獲取和轉移可移動抗性元件[3]，所以它可作為腸道中其他致病菌耐藥基因的“蓄水池”，促進耐藥性的傳播[5]。

耐藥糞腸球菌的傳播不僅危害人類健康，還影響養殖場經濟效益，一旦爆發會降低動物的生產性能，大幅增加養殖場的用藥成本。目前關于我國動物源腸球菌耐藥性的報道大多針對一種或兩種動物，多種動物源報道較少，新疆動物源腸球菌耐藥性的報道僅局限于新疆北部地區與阿克蘇地區的豬源糞腸球菌[6-7]、西北部地區(伊犁和塔城等地)的動物原奶、手工乳酪中分離出的屎腸球菌[8]，從藥敏結果看耐藥情況較為嚴重，而糞腸球菌在新疆多種動物腸道中的分布情況及耐藥基因攜帶情況尚不明確。因此，本研究以新疆9個縣區分離的雞源、豬源、牛源、羊源、鴿源和駱駝源糞腸球菌為研究對象，進行耐藥性調查以及相關耐藥基因檢測，為了解新疆多種動物源糞腸球菌的耐藥現狀及耐藥基因攜帶情況，為臨床用藥提供科學依據，同時也為解析糞腸球菌的多重耐藥機制提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

2015年在石河子地區采集羊源肛拭子樣品110份。2016年在烏魯木齊市米東區采集雞源肛拭子42份。2019年在昌吉地區采集豬源肛拭子90份，在阿勒泰福?？h采集駱駝源肛拭子49份，在伊犁察布查爾錫伯自治縣采集牛源肛拭子135份，在五家渠采集牛源肛拭子18份，在和田墨玉縣采集鴿源肛拭子100份。2020年在阿勒泰布爾津縣采集駱駝源肛拭子20份。采集4個年份的樣品共計564份。標準質控糞腸球菌(ATCC29212)與金黃色葡萄球(ATCC29213)購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2主要試劑和培養基

腦浸出液(BHI)肉湯培養基購自北京奧博星生物技術有限公司；MH肉湯、腸球菌選擇培養基(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂)購自青島海博生物技術有限公司；尿道菌群定位顯色培養基購自法國科瑪嘉；1×TE緩沖液購自生工生物(上海)有限公司；2×TaqPCR Master Mix，D2 000 DNA Maker購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細菌分離鑒定

用滅菌棉簽沾取動物肛門內新鮮糞便，放入裝有1 mL MH肉湯的EP管中。吸取10 μL MH肉湯中的樣品至1 mL 6.5%氯化鈉BHI肉湯中，過夜培養后將增菌液劃線接種于腸球菌選擇培養基平板上，37 ℃培養16～20 h后，挑取白色圓滑、凸起、大小適中且菌落周圍顯黑色的單一菌落，置于1 mL BHI肉湯，過夜培養后將增菌液劃線接種于尿道菌群定位顯色培養基平板上，37 ℃培養16～20 h后挑取大小合適的藍綠色單菌落于1 mL BHI肉湯，42 ℃培養16～20 h，初步鑒定為腸球菌。通過PCR方法對糞腸球菌持家基因進行擴增[9]，采用煮沸裂解法提取分離株總DNA作為PCR模板，提取標準質控糞腸球菌(ATCC29212)的總DNA作為PCR陽性對照。擴增產物經加核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的片段進行膠回收并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果用BLAST進行序列比對，相似性>96.0%的結果判定該菌株為糞腸球菌。

1.2.2菌株保存

確定為糞腸球菌的菌株接種在BHI肉湯隔夜培養后，加入滅菌甘油，制成20.0%甘油菌，-20 ℃冰箱保存。

1.2.3藥物敏感性試驗

根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)推薦的動物源細菌抗菌藥物敏感性試驗瓊脂稀釋法執行標準進行試驗操作[10]，對分離的糞腸球菌進行11種抗菌藥物(恩諾沙星、阿米卡星、慶大霉素、利福平、氟苯尼考、多西環素、四環素、紅霉素、萬古霉素、利奈唑胺和氨芐西林)的最小抑菌濃度測定。

1.2.4耐藥基因的檢測

根據所選藥物相對應的耐藥基因進行檢測。參考文獻[11-19]已有序列合成引物(表1)，引物由生工生物(上海)有限公司合成。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證后，將目的片段進行膠回收并送生工生物(上海)有限公司測序。測序結果經BLAST進行序列比對后確定基因型。

1.2.5數據分析

采用IBM SPSS Statistics 26.0進行數據分析。單因素分析采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 糞腸球菌的分離鑒定

由表2可知，共采集4個年份不同動物的樣品共計564份，經糞腸球菌持家基因擴增分離鑒定(圖1為部分結果)得到242株糞腸球菌，分離率為42.9%(242/564)。雞源糞腸球菌的分離率(95.2%，40/42)顯著高于其他動物源糞腸球菌(P<0.05)，豬源糞腸球菌分離率為61.1%(55/90)，牛源糞腸球菌(35.9%，55/153)、羊源糞腸球菌(34.5%，38/110)、鴿源糞腸球菌(34.0%，34/100)與駱駝源糞腸球菌(29.0%，20/69)的分離率差異不顯著(P>0.05)。

表2 動物源糞腸球菌的分離率Table 2 Isolation rate of E. faecalis from animal

2.2 糞腸球藥敏試驗分析

分離的242株糞腸球菌對紅霉素、四環素、多西環素和利福平的耐藥率最高，均大于80.0%，對萬古霉素和氨芐西林高度敏感，無耐藥菌株檢出。此外，檢出10株利奈唑胺耐藥菌。

表3為6種動物源糞腸球菌對11種抗菌藥物的耐藥率。鴿源糞腸球菌、雞源糞腸球菌、牛源糞腸球菌、駱駝源糞腸球對恩諾沙星耐藥率在20.0%～41.2%，顯著高于豬源糞腸球菌(5.5%)與羊源糞腸球菌(0)(P<0.05)；鴿源糞腸球菌、豬源糞腸球菌與牛源糞腸球菌對阿米卡星的耐藥率均大于80.0%，顯著高于羊源糞腸球菌(7.9%)、雞源糞腸球菌(27.5%)與駱駝源糞腸球菌(25.0%)(P<0.05)；牛源糞腸球菌對慶大霉素的耐藥率為96.4%，顯著高于其他源糞腸球菌(P<0.05)，其中羊源糞腸球菌的耐藥率為7.9%，顯著低于其他源糞腸球菌(P<0.05)；豬源糞腸球菌、牛源糞腸球菌、雞源糞腸球菌、駱駝源糞腸球菌對紅霉素的耐藥率均大于90.0%，顯著高于羊源糞腸球菌(42.1%)與鴿源糞腸球菌(52.9%)；四環素的耐藥嚴重程度從高到低依次為豬源糞腸球菌(100.0%)、牛源糞腸球菌(96.4%)、雞源糞腸球菌(92.5%)、駱駝源糞腸球菌(80.0%)、鴿源糞腸球菌(67.6%)、羊源糞腸球菌(34.2%)；豬源糞腸球菌、牛源糞腸球菌、雞源糞腸球菌、駱駝源糞腸球菌對多西環素的耐藥率均大于80.0%，顯著高于羊源糞腸球菌(47.4%)與鴿源糞腸球菌(55.9%)(P<0.05)；羊源糞腸球菌(0)與雞源糞腸球菌(10.0%)對氟苯尼考的耐藥率顯著低于其他源糞腸球菌(P<0.05)。利福平的耐藥嚴重程度從高到低依次為鴿源糞腸球菌(100.0%)、牛源糞腸球菌(92.7%)、豬源糞腸球菌(87.3%)、駱駝源糞腸球菌(85.0%)、雞源糞腸球菌(72.5%)、羊源糞腸球菌(52.6%)。通過上述分析不同動物源糞腸球菌對抗菌藥物的耐藥嚴重程度從高到低依次為牛源、豬源、鴿源、雞源、駱駝源和羊源。

2.3 糞腸球菌多藥耐藥性分析

242株動物源糞腸球菌菌株多藥耐藥在0～9耐有分布，3耐及3耐以上占84.7%(205/242)，以5耐和6耐為主，占53.7%(130/242)。豬源與駱駝源糞腸球菌多藥耐藥以5耐為主，分別占58.2%(32/55)和45.0%(9/20)；雞源糞腸球菌以5耐和6耐為主，占70.0%(28/40)；牛源糞腸球菌以6耐為主，占56.4%(31/55)；羊源糞腸球菌多藥耐藥以0～4耐為主，占97.4%(37/38)；鴿源糞腸球菌以2耐和7耐為主，占44.1%(15/34)(表4)。

豬源糞腸球菌共有14種耐藥譜型，在3～9耐有分布，以ERY-TET-DOX-RFP-AMK為主，占比為43.6%(24/55)。羊源糞腸球菌共12種耐藥譜型，在1～5耐有分布，以ERY-TET-DOX-RFP主，占比為18.4%(7/38)。駱駝源糞腸球菌共10種耐藥譜型，在1耐與3～7耐有分布，以TET-GEN-ERY-DOX-RFP為主，占比為40.0%(8/20)。牛源糞腸球菌共15種耐藥譜型，在2耐與4～9耐有分布，以AMK-TET-GEN-DOX-RFP-ERY為主，占比為43.6%(24/55)。雞源糞腸球菌共16種耐藥譜型，在1～8耐有分布，以TET-DOX-GEN-ERY-RFP為主，占比為20.0%(8/40)。鴿源糞腸球菌共16種耐藥譜型，在2～9耐有分布，以AMK-RFP與AMK-TET-RFP-ERY-DOX-GEN-ENR為主，各占14.7%(5/34)。

2.4 糞腸球菌耐藥基因分析

242株動物源糞腸球菌除cfr和poxtA基因未檢出外，其他8種耐藥基因均有檢出，tetM基因(78.1%)檢出率最高，aph(3′)-Ⅲ、aac(6′)/aph(2″)和ermB基因的檢出率也高達70.0%以上。

由表5可知不同動物源糞腸球菌中耐藥基因檢出結果，豬源糞腸球菌耐藥基因攜帶率最高，ermB(100.0%)基因攜帶率顯著高于其他動物源糞腸球菌(P<0.05)。豬源糞腸球菌檢出8種耐藥基因，ermA基因(5.5%)僅在豬源糞腸球菌中檢出。豬源、雞源、牛源和駱駝源糞腸球菌tetM基因的攜帶率均大于80.0%，顯著高于鴿源(55.9%)與羊源(26.3%)糞腸球菌(P<0.05)。aac(6′)/aph(2″)基因的攜帶率從高到低依次為牛源(100.0%)、豬源(96.3%)、駱駝源(80.0%)、雞源(75.0%)、鴿源(38.2%)、羊源(28.9%)。羊源、鴿源糞腸球菌對aph(3′)-Ⅲ基因的攜帶率顯著低于其他源糞腸球菌(P<0.05)。

3 討 論

糞腸球菌作為腸球菌屬中臨床分離率最高的菌種[20]，耐藥機制復雜，易產生耐藥性，成為耐藥基因的貯存庫，獲得性交叉耐藥等問題給獸醫及人醫臨床帶來了巨大挑戰[21]。本研究以新疆9個縣區分離的6種動物源糞腸球菌為研究對象，分析不同動物源糞腸球菌的耐藥特點及耐藥基因攜帶情況，對于臨床用藥具有指導意義。

本研究中新疆9個縣區糞腸球菌的整體分離率為42.9%，略高于魏蓮花等[22]報道的中國西部地區人醫臨床糞腸球菌與李延山等[23]報道的東北地區不同動物源糞腸球菌的分離率。不同動物源以雞源糞腸球菌分離率最高，達95.2%，高于李金磊等[24]報道的河南省部分地區雞源糞腸球菌分離率(55.6%)。本研究中豬源糞腸分離率為61.1%，與王舒豐等[7]報道的阿克蘇地區豬源糞腸球分離率基本一致。牛源、鴿源、駱駝源和羊源糞腸球菌的分離率差別不大，都在30.0%左右。結果顯示，糞腸球菌作為腸道共生菌在不同動物中具有較高分離率，但在不同動物體內的比例具有一定差異性。

藥敏試驗結果表明，不同動物源糞腸球菌對四環素、多西環素和紅霉素的高耐藥率與姚曉慧等[25]報道的糞腸球菌的耐藥結果基本一致，分析高耐藥率產生的原因，可能是由于四環素類與大環內酯類的一些抗菌藥物屬于農業部批準的飼料藥物添加劑，從而導致菌株對其耐藥嚴重；此外，利福平、慶大霉素和阿米卡星，這3種藥物的耐藥率也偏高，其原因可能是這幾種藥物的性價比高，長期不規范使用導致耐藥菌株的大量出現。豬源糞腸球菌對恩諾沙星的耐藥率(5.5%)相較于其他幾種常用藥物耐藥率較低。新疆不同動物源糞腸球菌對氟苯尼考(16.1%)與氨芐西林(0)的耐藥率總體偏低，提示該藥物可作為治療不同動物細菌性疾病的備選藥物。未檢出耐萬古霉素腸球菌(Vancomycin-resistantEnterococcus，VRE)。值得注意的是，檢出10株利奈唑胺耐藥菌株，其原因可能是與酰胺醇類藥物交叉耐藥所致，例如氟苯尼考。雖然不同動物源糞腸球菌對氟苯尼考耐藥率較低，但也應嚴格控制該藥物的使用，通過聯合用藥或輪換用藥減少氟苯尼考耐藥菌株的出現，從而避免利奈唑胺耐藥菌株的爆發。

不同動物源糞腸球菌菌株多藥耐藥集中在5耐和6耐，耐藥譜型以ERY-TET-DOX-RFP-AMK-GEN為主。不同動物源糞腸球菌的耐藥譜型差別較大，其原因可能是，菌株來源于不同地區不同動物，用藥習慣存在差異。牛源、豬源和駱駝源糞腸球菌耐藥率高，耐藥情況最為嚴重，其原因可能是因為這3種動物飼養周期長，使用抗菌藥物幾率更高，導致分離菌株耐藥嚴重。鴿源與雞源糞腸球菌耐藥譜最廣，耐藥率較高，其原因可能是養殖戶缺乏規范用藥意識，不合理使用甚至濫用藥物，導致多耐菌株和高耐菌株的出現。羊源糞腸球菌對被檢藥物的耐藥率整體偏低，對多種藥物敏感性良好，其原因可能是養殖場用藥合理，采樣的羊群為一月齡胡羊，多數未使用抗菌藥物。不同養殖場可根據藥敏試驗結果與耐藥譜型，在目前的用藥模式上合理選用具有較高敏感性的抗菌藥物，在提高治療效果降低經濟成本的同時，也可緩解交叉耐藥情況的產生。

本研究耐藥基因檢測結果顯示，新疆動物源糞腸球菌耐藥基因攜帶率高，對被檢測的5大類耐藥基因均有檢出。豬源糞腸球菌對被檢耐藥基因的攜帶率最高，檢出的種類也最多，其次為牛源糞腸球菌，其原因可能是樣品采集的豬場和牛場飼養動物密集，攜帶多種耐藥基因的糞腸球菌易通過糞便、污水等進行傳播。羊源耐藥基因攜帶率最低與藥敏試驗結果相符。tetM(78.1%)、ermB(71.5%)基因的攜帶率與Molechan等[26]報道的南非雞源腸球菌一致，但aac(6′)/aph(2″)(73.6%)、aph(3′)-Ⅲ(74.0%)基因的攜帶率卻顯著高于其報道，略低于國內吳安琪等[27]的報道。其原因可能是對于氨基糖苷類藥物國內用藥習慣與國外存在差異，相關部門應加大監察力度，規范該類藥物合理使用。氟苯尼考的耐藥率為16.1%，與酰胺醇類耐藥基因fexA檢出率(16.9%)基本一致。雖然噁唑烷酮類多藥耐藥基因cfr與poxtA基因未檢出，但是optrA基因檢出率高達9.1%，除羊源未檢出外，其他動物源均有檢出。少數攜帶該基因的菌株對利奈唑胺沒有表現出耐藥，但為中介值，結果印證Osei等[28]報道的藥敏試驗中介的菌株也可能擴增出相應耐藥基因的結論。optrA基因不僅介導對酰胺醇類抗菌藥物和利奈唑胺的耐藥，還可介導對2014年被美國FDA批準上市的新一代噁唑烷酮類藥物—泰地唑利的耐藥，該藥被批準用于臨床治療耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)和耐甲氧西林的凝固酶陰性的葡萄球菌(Methicillin-resistant coagulase negativestaphylococci，MRCoNS)等多重耐藥菌引起的感染[14]。因此，應該注意對該基因的持續監測，避免交叉耐藥危害人類健康。

綜上所述，糞腸球菌在新疆9個縣區的6種動物糞樣均中具有較高的檢出率，且分離到的糞腸球菌對四環素、紅霉素、多西環素和利福平的耐藥率高，養殖過程中應減少這4種藥物的使用，可根據藥敏結果選用恩諾沙星、氟苯尼考和氨芐西林等敏感性高的藥物來提高療效。豬、牛和駱駝，飼養周期長的動物，耐藥嚴重，耐藥基因攜帶率高，應嚴格控制抗菌藥物的使用，合理輪換用藥。雞、鴿在飼養過程中，應注意用藥的規范化，避免濫用藥物。在除羊外的5種動物中，均檢出噁唑烷酮類耐藥基因optrA，提示應該注意酰胺醇類藥物的使用與相關耐藥基因的持續監測，實驗室與臨床結合，避免交叉耐藥的產生，保護公共衛生安全。