山西省仔豬黃白痢大腸桿菌耐藥性研究

馮曉東，劉風波，連亮亮

(1.呂梁農業學校，山西 呂梁 032200；2.長治市襄垣職業技術學校，山西 長治 046200；3.長治市農業綜合行政執法隊，山西 長治 046000)

仔豬黃白痢為新生仔豬常見的大腸桿菌病，會嚴重危害養豬生產，并會造成巨大的經濟損失。對于本病的防治，豬場除了加強飼養管理和衛生消毒措施，以及用自家流行菌株免疫母豬，唯有多選用敏感藥物進行治療；然而，大腸桿菌具有眾多的血清型，各地流行菌株的血清型各不相同。隨著抗生素的大量使用，大腸桿菌的耐藥性菌株也不斷出現。為了摸清山西省各地仔豬黃白痢流行病原菌株，指導豬場臨床用藥，本研究對省內各地豬場的新生仔豬黃白痢病例進行了病原分離、鑒定和耐藥性監測。

原文：England are home to 200 different nationalities.

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料

隨著國家供給側改革以及更為嚴格的安全環保政策的不斷推進和深化，中國農藥行業正在變革，不少企業不得不停產整頓，甚至面臨被淘汰的風險。

因發生仔豬黃白痢，山西省10家規?；i場仔豬病死60例，在仔豬死后24 h內，采集病變的組織或器官樣本，采集過程中要盡可能避免樣本被污染。

1.1.2 質控菌株

稱取營養瓊脂4.5 g溶于100 mL蒸餾水中，加熱溶解，然后放入高壓鍋高壓滅菌20 min。待冷卻至50 ℃～60 ℃之后取出，在超凈工作臺內將溶液傾倒入經過滅菌的平皿中，待其冷卻凝固后取病料接種菌種。接種完畢后置于37 ℃恒溫箱中培養24 h備用。

按常規方法進行三糖鐵試驗、吲哚試驗、甲基紅驗、二乙酰試驗、糖發酵試驗、檸檬酸鹽利用試驗。

2.1 兩組DDI及DDI各階段時間的比較 觀察組產婦的DDI以及決定手術至麻醉開始時間低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，而兩組的麻醉時間、手術切皮至胎兒娩出時間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

試驗所用儀器設備有比濁管、試管、培養皿、接種環、酒精燈、恒溫培養箱、冰箱、打孔器、真空抽氣機、干燥器、測量尺、電子天平、超凈工作臺。

1.1.4 標準比濁管的制備

取10支比濁管，給第1支比濁管裝入0.048 mol/L(即濃度為1.175%)氯化鋇0.5 mL，加0.18 mol/L(即濃度為1%)硫酸溶液99.5 mL，充分攪勻，隨后的9支濁管依次類推，濃度逐漸升高。選管徑與接種菌液相同的試管，每支分裝10 mL，密閉，在室溫下置于暗處保存,其濁度為0.5麥氏比混標準(Mcfarland standard)，相當于108CFU/mL的含菌量。使用前應充分搖勻[1]。

1.1.5 接種菌液的制備

大腸埃希菌ATCC25922購于中國獸藥監察所。

用滅菌的接種環挑取瓊脂平板上形態相同的4～5個菌落，接種于3 mL～5 mL水解酪蛋白(mueller-hinton，M-H)肉湯中，在35 ℃下培養6 h，隨后用滅菌生理鹽水稀釋培養液，使其濃度相當于標準比濁管[2]。

1.1.6 培養基的制備

制備普通營養肉湯、普通營養瓊脂、葡萄糖蛋白胨、M-H培養基(K-B試驗專用）瓊脂。

為了全面地把握普查績效的綜合狀況，克服評價的片面性，將普查績效評價的五個主要因素對應各評價等級的隸屬度模糊量值計算其平均值、最大值與最小值，分別記為dk1，dk2，dk3。結合其相應的權重，建立單項評價模糊復合物元Rd和綜合評價模糊復合物元RD，則有：

1.1.7 試驗藥物

制備好的干燥藥敏紙片分裝在密封小瓶內，放在干燥器中低溫保存備用。

氨芐青霉素(ampcillin，Amp)、氯霉素(chloramphenicol，CM)、紅霉素(eryhromyci，Ery)、慶大霉素(gentamicin，GM)、丁胺卡那霉素(amikacin，Amk)、鏈霉素(gtreptomyces，SM)、復方新諾明(gulfamethoxazole，Sxt)、新霉素(neomin，N)、呋喃唑酮(furazolidone，Fd)、諾氟沙星(norfloxacin，Nor)、環丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、頭孢唑啉(cefazolin，Cfz)、強力霉素(doxcycline，Dox)、氟苯尼考(florfenicol，FLO)、多粘菌素(polymyxin，PXB)和恩諾沙星(enoxacin，ENO)共16種藥物純粉。

1.1.8 藥敏紙片的制備

2.動物園游覽時間集中在周末和自由支配時間，這既說明動物園游客來自工薪階層，又體現出其休閑旅游的典型特征。游客信息獲取渠道分散，說明動物園并沒有為此過多宣傳。但門票價格影響因素分析發現，游客總體上還是覺得門票價格偏高，而西鄉塘區外和多次游覽及非周末假期游覽的游客對門票價格的敏感度顯著降低。

她不僅在農科校打響，在鄉政府內也起到意想不到的作用。何副書記在她面前很莊重，而且不再松松垮垮，各站也不在上班時間打撲克了。因為她非要何副書記定幾條《規章制度》《懲罰條例》不可。奇怪的是，何副書記對她言聽計從，馬上照辦。然而令人費解的是，李文和幾個放蕩慣了的人對她心懷不滿，背后說她壞話時，何副書記卻聽之任之，充耳不聞，置之不理。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離培養

神像高一丈，身體由整塊的白玉雕鑿而成，雙翼則是用青碧色的翡翠雕刻。一束月光從神殿頂部預留的天窗直射而下，打在神像上，令神像的身體泛起柔柔的白芒，雙翼青光流轉，仿佛隨時都要振翅沖天。

挑選單個菌落，經染色鏡檢證明不含雜菌，此時用接種環挑選單個菌落，移植于各種瓊脂斜面培養，所得的培養物即為純培養物，培養后膠塞密封，置－4O ℃冰箱中保存備用。

病死仔豬的組織培養物涂片染色鏡檢，均可見兩端鈍圓，多數散在排列，偶爾有2～3個連在一起的革蘭陰性短桿菌。

在麗江供電局的高度重視下，通過一系列改造措施后，麗江客戶滿意度持續提升，2017年、2018年連續兩年國慶、春節未出現12398、95598投訴事件，甚至在今年極端天氣雷暴大雨災害中麗江古城內全面實現了“零停電”、故障“零報修”，無人員發生因大雨天氣意外觸電事件，截至目前未出現任何負面輿情現象，贏得了廣大用電客戶的一致好評。(楊紹豪 歐陽婷婷 田曉玲)

將待檢菌株做成菌液涂片，用革蘭染色法染色，選取在顯微鏡視野中顯示為紅色或粉紅色的兩端鈍圓、兩端濃染的中等大小的革蘭陰性桿菌菌株進行生化鑒定。

1.2.3 菌株的生化鑒定

1.1.3 主要儀器設備

運用Python語言調用Arcpy制圖模塊實現同一空間中所有數據鏈接修復，無需打開地圖文檔即可自動更改數據鏈接。首先，對地圖工程模板中的數據庫進行替換并另存一個新的目標工程；然后，對新的地圖工程文件進行數據修復。運用Python語言如下：

1.2.4 致病性試驗

取120只體重18 g～22 g的健康小白鼠。挑取普通瓊脂斜面上純培養的菌落，接種于營養肉湯培養基中。隨機選取60只小白鼠作為試驗組，腹腔注射肉湯培養物0.1 mL/只；剩下的60只小白鼠作為對照組，腹腔注射肉湯0.1 mL/只，24 h～48 h內觀察小鼠的死亡情況，取死亡或發病的小白鼠肝臟抹片，革蘭染色、鏡檢，并取病料接種于麥康凱瓊脂觀察結果。

1.3 藥敏試驗

本藥敏試驗采用紙片瓊脂擴散法。

2 試驗結果

2.1 分離培養

在普通瓊脂平皿板上長出表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、圓形微凸起、中等大的菌落，直徑2 mm～3 mm。在血液瓊脂平板上長出菌落較大、邊緣整齊并有隆起的灰白色菌落，多數不溶血。在麥康凱瓊脂平板上生長出圓形、光滑、隆起、大小均一的紅色菌落(中央顏色稍深)；普通肉湯呈均勻一致混濁狀。

2.2 細菌形態學觀察

1.2.2 鏡檢

2.3 動物致病力試驗結果

在試驗組60只小白鼠中，42只在24 h內死亡，16只在30 h死亡，另外2只發??；對照組小白鼠不發病。發病及死亡小白鼠的心血抹片經革蘭染色鏡檢為革蘭陰性中等小桿菌，將該心血接種于麥康凱瓊脂培養基上均為紅色菌落。

由于度量尺度不統一（up-to-scale）的原因，并不能使用雙目三維重建同樣的方法去處理多視圖三維重建。引入透視N點法（Perspective N Point，PNP）將雙目三維重建拓展到多視圖重建三維場景。有很多關于透視N點法的研究，如P3P、P4P、P5P[19-20]等。但為了提高重構算法的魯棒性，一般使用多于4個特征點的算法來解決實際應用中的問題。PNP算法大致通過求得前兩幅圖像中的特征點的三維坐標以及這些空間點在第三幅圖像中的像素坐標位置來計算估計第三幅視圖拍攝時的位置姿態。并類推到更多視圖的三維重建。

2.4 生化鑒定結果

60株菌均能在三糖鐵培養基上產酸產氣，使培養基變黃，均不產生硫化氫，均能發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇。甲基紅(methyl red，M-R)試驗、吲哚試驗為陽性。均不能利用檸檬酸鹽，伏-波試驗(voges-proskauer，V-P)試驗陰性。根據生化特性，表明分離的菌為大腸桿菌(表1)。

2.5 藥敏試驗結果

2.5.1 60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株對16種抗生素的耐藥情況

仔豬黃白痢大腸桿菌產生耐藥性嚴重的抗生素依次為SXT、CM、SM、FD、AMP、FLO、CIP、GM、NOR、AMK、ENO、N、ERY、DOX、CFZ、PXB，其中耐藥率大于或等于50%的9種抗生素，分別為SXT、CM、SM、FD、AMP、FLO、CIP、GM和NO；耐藥率小于30%的抗生素有3種，分別為DOX、CFZ、PXB；結果見表2和圖1。

2.5.2 60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株對16種抗生素的多重耐藥情況

在課堂上我們利用微課小視頻進行教學，在課后我們仍舊可以利用微課讓學生鞏固課堂知識。課堂的時間是有限的，我們在抓住課堂時間進行教學時，也需要讓學生科學合理地利用課后時間，因為課后學習很多時候沒有教師請教也沒有同學討論，這時候微課的價值就得到了充分的體現，學生可以根據自己的實際學習情況選擇微課學習，在微課堂中討論學習內容等。另外我們鼓勵學生運用微課的同時，我們自己也要善于利用微課，讓微課更好地服務學生、服務數學課堂。我們在教學過程當中可以通過微課不斷學習優秀教師的教學方法，使其內化到自己的教學體系當中，從而更好地傳授學生知識、引導學生學習，這樣才能使課堂質效有更好的提升。

在60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株中，沒有不耐藥和僅耐1種、2種抗生素的分離菌株，對3種、4種、5種、8種、9種、10種、11種、13種和14種抗生素有耐藥性的大腸桿菌分離株分別為2株、5株、4株、7株、3株、15株、11株、8株和5株，結果見圖2。

2.5.3 60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株的耐藥譜

60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株有45種耐藥譜。4株分離株的耐藥譜完全相同，大多數分離株都具有不同的耐藥譜。主要的耐藥譜見表3。

3 分析與討論

3.1 60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株藥敏試驗及耐藥譜分析

采用Kirby-Bauer法，60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株的藥敏試驗結果(圖1)表明，在16種抗生素中，抑菌作用最強的是獸醫臨床上尚未使用或應用較少的頭孢唑啉和多粘菌素，敏感菌株分別占90.0%(54/60)、90.0%(54/60)；其次為強力霉素、紅霉素、新霉素和恩諾沙星，敏感菌株分別占73.3%(44/60)、70.0%(42/60)、68.3%(41/60)和63.3%(38/60)；而復方新諾明、氯霉素、鏈霉素、呋喃唑酮和氨芐青霉素等藥物則表現出很高的耐藥性，耐藥率分別為88.3%、81.7%、78.3%、75.0%和73.3%；環丙沙星及諾氟沙星的耐藥率也很高，分別為60.0%和56.7%。這與國內外有關文獻大體吻合。馬紅霞等報道，大腸桿菌對氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、呋喃妥因同時耐藥的菌株已達半數；RolandLanz等報道豬(腹瀉、水腫病)大腸桿菌分離株對慶大霉素、鏈霉素、壯觀霉素、四環素、呋喃妥因的耐藥性多見，對恩諾沙星的耐藥率較高。

3.2 關于抗菌藥物的使用方法

抗菌藥物的選擇應考慮采取聯合用藥、交叉用藥、輪換用藥的方式，一方面可以充分發揮抗菌藥物之間的協同作用，增加療效：另一方面可以避免細菌長期與某一種藥物接觸，增加耐藥性的產生概率。

建議停用已普遍產生耐藥性和臨床上已明顯無效的藥物，選用目前應用較少和經藥敏試驗證明對仔豬黃白痢大腸桿菌敏感的先鋒霉素、多粘菌素、壯觀霉素等藥物。敏感藥物的選擇空間十分狹小，而研發新藥又需要大量的人力、物力和財力，并且還有研制周期長、風險大等問題[3]，因此，開展聯合應用抗菌藥物的研究，充分發揮抗菌藥物之間的協同作用，顯得十分必要和迫切。

4 結論

隨著抗生素在養豬生產中不斷使用，耐藥性菌株不斷涌現，且出現的菌株多為對多種甚至是14種抗生素有耐藥性，這些結果與杜銀中、朱力軍及馬紅霞等報道的基本一致。如果在生產中仍不加控制地使用抗生素，隨著時間的推移，大腸桿菌的耐藥率必將大幅度上升，多重耐藥菌株將迅增，耐藥譜增寬[4]，豬病的防治將面臨嚴峻的挑戰。因此，廣大養豬生產者應嚴格遵守禁抗令，給動物生產營造一個科學的用藥環境。