miR-34a-5p 下調Notch1 表達增強三陰性乳腺癌MDAMB-231 細胞對紫杉醇的敏感性

蔡 霈，樂伊婕，邱葉貝，鄭 藝，李 慧，曹建國，李 程，佘志華

（1.湖南省婦幼保健院，長沙 410008；2. 湖南師范大學醫學院，長沙 410006）

MicroRNA-34a（miR-34a）是一種內源性小非編碼單鏈RNA，亦是一種重要的腫瘤抑制性miRNA［1］。miR-34a 在正常組織中高表達；而在各種類型腫瘤，如肝細胞癌和胰腺癌中通常表觀遺傳沉默［2，3］。miR-34a能直接靶向抑制多種在惡性腫瘤發生和發展中起重要作用的致癌性轉錄因子、信號分子和CSC 標志物，包括CD44 和Notch-1 等［4，5］。本文旨在探討miR-34a-5p 對三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細胞Notch1 表達和紫杉醇敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人乳腺上皮細胞MCF-10A、人乳腺癌MDA-MB-231 細胞系購自中國科學院細胞庫（中國上海）；用含10%胎牛血清（FBS）、100 IU/mL 青霉素和 100μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基培養。置于含5%CO2培養箱中37℃培養。

1.2 實時熒光定量PCR 以TRIzol 試劑（美國，Life Technologies）提取MCF-10A、MDA-MB-231 細胞總RNA，按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis 試劑盒說明書操作將其逆轉錄合成為cDNA。以TaqMan實時熒光定量PCR（美國，Applied Biosystems）進行qRT-PCR 測定，2-△△Ct方法分析測定結果。miR-34a-5p 引物（廣州銳博生物科技公司）：F：5'-CGG TAT CAT TTG GCA GTG TCT-3'；R：5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3'。Notch1 引物（上海生工生物工程公司）：F：5'GGTGAGACCTGCCTGAATG'，R：5'GTTGGGGTCCTGGCATC 3'。

1.3 miR-34a mimic 瞬時轉染 miR-34a mimic（貨號：miR10004557-1-5）由廣州銳博生物科技公司提供。以Lipofectamine2000 質粒轉染系統將miR-34a mimic 轉染MDA-MB-231 細胞 24h。使用TRIzol 試劑（Invitrogen）從轉染后的MDA-MB-231 細胞中提取總RNA，以定量PCR 技術檢測miR-34a-5p 與Notch1 表達水平。

1.4 Western blot 檢驗 按前述發表文獻所述［6］，以RIPA 裂解緩沖液（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）于冰浴中裂解所收集的上述細胞30min，BCA 試劑盒（Pierce，Rockford，IL）測定蛋白濃度，每個樣品等量（40μg）以10% SDS-PAGE 分離后電轉至PVDF膜，5% BSA 室溫封閉1h，一抗β-actin（Santa Cruz Biotechnology，Inc，CA，USA，貨號：sc-7210）、Notch1（Cell Signaling Technology，Inc. Danvers，MA，USA，貨號：#3608）4℃孵育過夜。TBST 洗凈后以辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG 二抗室溫孵育1 h，ECL 試劑檢測蛋白條帶，化學發光系統（美國，Amersham Pharmacia Biotehc）拍照，以Image J 軟件計算灰度值。

1.5 CCK-8 法檢測細胞存活力 取對數生長期的MDA-MB-231 細胞（miR-34a mimic 轉染/亂序陰性對照）接種于96 孔培養板中，4000 個/每孔。待細胞貼壁完全，分別加入不同濃度紫杉醇（終濃度為0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 nM），72h 后移除培養基，每孔加入100μL含有10μL CCK-8 試劑（日本Dojindo 公司）的DMEM 培養基（1：9），孵育2h 后，用酶標儀于450nm 波長處測定吸光度值（A）并計算紫杉醇IC50值。

1.6 統計學分析 數據采用SPSS 23.0 進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析，與對照組的兩兩比較采用LSD-t 檢驗分析。P<0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MDA-MB-231 細胞低表達miR-34a-5p 為了確定miR-34a 表達水平是否與細胞異常增殖活性有關，我們評估了miR-34a-5p 在人乳腺細胞MCF-10A與三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細胞中的表達水平。結果表明人乳腺上皮細胞MCF-10A 中的miR-34a-5p表達水平遠高于人乳腺癌MDA-MB-231 細胞（圖1，P<0.05）。

圖1 qRT-PCR測定miR-34a-5p表達水平（mean±SD，n=3）與MCF-10A細胞比較，P<0.05。

2.2 miR-34a-5p 降低Notch1 mRNA 水平 為了確定miR-34a 對于Notch1 mRNA 表達的影響，我們采用miR-34a mimic 瞬時轉染MDA-MB-231 細胞，同時以qRT-PCR 檢測Notch1 mRNA 表達水平。圖2 表明，與培養基處理或亂序陰性對照轉染的MDA-MB-231 細胞相比，轉染miR-34a mimic 后的MDA-MB-231 細胞中Notch1 mRNA 表達水平顯著下降（P<0.05）。

圖2 qRT-PCR測定Notch1 mRNA表達水平（mean±SD，n=3）與親本MDA-MB-231細胞比較，*P<0.01 ；與亂序陰性對照寡核苷酸（miR-NC）轉染MDA-MB-231細胞比較，#P<0.05

2.3 miR-34a-5p 下調Notch1 蛋白表達 收集經miR-34a mimic 瞬時轉染的MDA-MB-231 細胞，提取蛋白后以western blot 分析Notch1 蛋白表達水平。如圖3 所示，與培養基處理或亂序陰性對照處理的MDA-MB-231 細胞相比，轉染miR-34a mimic 后的MDA-MB-231 細胞中Notch1 蛋白表達水平顯著下降（P<0.05）。

圖3 蛋白質免疫印跡分析Notch1蛋白表達水平（mean±SD，n=3）與親本MDA-MB-231細胞比較，*P<0.01 ；與亂序陰性對照寡核苷酸（miR-NC）轉染MDA-MB-231細胞比較，#P<0.05

2.4 miR-34a-5p 增強MDA-MB-231 細胞對紫杉醇的敏感性 CCK-8 試劑盒測定紫杉醇抑制MDAMB-231 或經miR-34a-5p 轉染的MDA-MB-231 細胞存活力的IC50值。結果如圖4 所示，與培養基處理或亂序陰性對照處理的MDA-MB-231 相比，紫杉醇在轉染miR-34a mimic 后的MDA-MB-231 細胞的IC50值顯著下降（P<0.05）。

圖4 紫杉醇抑制MDA-MB-231細胞存活力IC50值（mean±SD，n=3）與親本MDA-MB-231細胞比較，*P<0.01 ；與亂序陰性對照寡核苷酸（miR-NC）轉染MDA-MB-231細胞比較，#P<0.05

3 討論

本研究的實驗結果表明：三陰性乳腺癌細胞MDAMB-231 中miR-34a-5p 表達水平遠低于人乳腺細胞MCF-10A，提示：miR-34a-5p 在腫瘤細胞中表觀遺傳沉默；通過轉染外源性miR-34a mimic 增加MDAMB-231 細胞中miR-34a-5p 表達，能夠使Notch1 mRNA 與蛋白表達水平降低，而紫杉醇在敲低Notch1表達的MDA-MB-231 細胞IC50值下降。提示：miR-34a 能夠通過調控Notch1 表達從而影響腫瘤細胞對于紫杉醇的敏感性。

許多研究證明，miR-34a 作為一種重要的腫瘤抑制性miRNA，能夠直接靶向抑制多種惡性腫瘤發生和發展中的致癌性相關因子。miR-34a 能夠抑制乳腺癌細胞增殖，同時能夠抑制乳腺癌細胞遷移與侵襲［7，8］。Notch1 信號通路與乳腺癌發生、耐藥密切相關，Notch1異常表達是乳腺癌預后不良的標志［9］。Notch1 作為一種干細胞基因，還參與乳腺癌干細胞的維持和自我更新，同時影響ABC 轉運蛋白（如P-gp）與抗凋亡蛋白Bcl-2 家族成員表達，這些相關蛋白表達變化與腫瘤細胞的多藥耐藥、復發、侵襲和轉移密切相關［10，11］。本文證實miR-34a-5p 負性調控三陰性乳腺癌MDAMB-231 細胞的靶基因Notch1 表達；過表達miR-34a-5p 能抑制Notch1 轉錄和蛋白表達從而增強紫杉醇對三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細胞存活力抑制作用，這些結果為以miR-34a/Notch1 軸作為腫瘤治療靶標及臨床療效預測標志物提供了實驗證據。

總而言之，本文的研究證實miR-34a-5p 調節三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細胞Notch1 表達從而增強化療藥物細胞毒作用，為miR-34a/Notch1 軸作為耐藥乳腺癌早期診斷標志物與腫瘤治療過程中的關鍵靶標提供了實驗依據，并揭示了miR-34a-5p 負性調控Nocht1轉錄的分子機制。