芹菜素經上調miR148a-3p 表達抑制MHCC97H 細胞遷移和侵襲

劉麗華，孫 菲，周志凌，張堅松

（1. 珠海市人民醫院/暨南大學附屬珠海醫院，珠海 519000；2. 湖南師范大學醫學院，長沙 410013）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的高侵襲轉移是亟待解決的臨床治療難題［1］。新近的研究顯示非編碼調控性微小RNAs（microRNAs）能有效地抑制HCC 細胞遷移和侵襲［2，3］。我們先前的研究證明芹菜素（apigenin，API）類似物異牡荊素抑制HCC 腫瘤干細胞特性和侵襲能力［4］，然而，其作用機制尚未完全闡明。本文旨在研究API 是否通過上調miR-148a-3p 表達抑制體外HCC 細胞遷移和侵襲能力。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與處理 高侵襲性人肝細胞癌MHCC97H 細胞系購自中國科學院細胞庫（中國上海市）。按照先前文獻的描述［4］，細胞放置在37°C、飽和濕度的5% CO2 培養箱中單層貼壁生長；然后，通過陽離子脂質體轉染miR-148a-3p 模擬物或不同濃度的API（apigenin，API：5、10 和20μM）或API（20μM）聯合miR-148a-3p 抑制物轉染MHCC97H 細胞處理24 小時。

1.2 miRNA 轉染 如先前文獻［5］的闡釋的方法，按照制造商的說明（RiboBio，中國廣州市），用iboFECT?CP 試劑將micrON?miR-148a 模擬物（50 nM）或抑制物（100 nM）轉染入MHCC97H 細胞。同時，按照相同的方法和步驟轉染miR-148a-3p 模擬物的陰性對照（miRCtrl）或miR-148a-3p 抑制物的陰性對照（Anti-Ctrl）。

1.3 實時定量PCR 參考文獻［5］的實驗方法，用miRcute miRNA 分離試劑盒（cat. DP501，Tiangen Biotech，中國）制備總microRNA?；赥aqMan MicroRNA 分析（Applied Biosystems）的All-in-One?miRNA qRT-PCR 檢測試劑盒轉錄和擴增總miRNA（2μg），以測定microRNA 的量。用2-ΔΔCt方法分析結果。研究使用的引物是：成熟miRNA-148a-3p（F：TGCGGTCAGTGCACTACAGAAC；R：CCAGTGCAGGGTVVGAGGT）和內參U6（F：5'-CGC TTC GGC AGC ACA TAT ACT A-3'；R：5'-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC A-3'。

1.4 劃痕法 參照文獻［4］的描述，轉染的MHCC97H細胞或不同濃度的API（apigenin，API：5、10 和20μM）或API（20μM）聯合miR-148a-3p 抑制物處理細胞接種于6 孔細胞培養板，生長至90%匯合度。然后，用無菌的100μL 微量移液器的吸頭垂直劃過形成傷口。接下來，洗滌細胞并分別于0 和24h 時在放大倍數為100 的視野中拍照分析。miR-Ctrl 或Anti-Ctrl 或溶媒（0.1%DMSO）處理MHCC97H 細胞用于標化遷移細胞率（%）。

1.5 Transwell 小室侵襲試驗 參照文獻［4］的描述，用基質膠包被的8μm 孔膜Transwell 系統（Corning Incorporated，NY，USA）進行細胞侵襲測定。簡而言之，在有或沒有API 的況下，無血清DMEM 培養基懸浮的MHCC97H 細胞接種入上室。含10%胎牛血清完全培養基加入下室中，作為化學誘導劑，培養24 小時。侵襲細胞用甲醇固定，并行瑞氏染料染色，并用Vectashield 固定溶液（Vectorshield，Vector Laboratories）固定。光學顯微鏡（Olympus DP72，德國漢堡）拍照（放大倍數：200）。

1.6 統計學處理 用SPSS 20.0 軟件（IBM，Armonk，NY，美國）進行統計分析。數據為平均值±標準差。非配對雙尾Student’s t 檢驗比較實驗組與對照組之間的均數。用單因素方差分析的post-hoc Tukey's 檢驗進行各組均數的兩兩比較。P<0.05 認為有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-148a-3p 抑制MHCC97H 細胞遷移能力

圖1 顯示：miR-148a-3p 轉染顯著降低體外培養MHCC97H 細胞遷移率（P<0.05）。

圖1 miR-148a-3p模擬物抑制體外培養MHCC97H細胞遷移能力（mean±SD，n=3）

2.2 miR-148a-3p 降低MHCC97H 細胞侵襲率 圖2可見：miR-148a-3p 顯著降低體外培養MHCC97H 細胞侵襲率（P<0.05）。

圖2 miR-148a-3p模擬物抑制體外培養MHCC97H細胞侵襲能力（mean±SD，n=3）

2.3 API 上調MHCC97H 細胞miR-148a-3p 表達圖3 示：與0.1 % DMSO 處理的MHCC97H 細胞相比，API（5、10 和20μM）以濃度依賴方式增高MHCC97H 細胞miR148a-3p 表達水平（P<0.05）。

圖3 API顯著上調MHCC97H細胞miR-148a-3p表達（mean±SD，n=3）RT-qPCR分析MHCC97H細胞miR-148a-3p表達水平。與溶媒（0.1%DMSO）處理的MHCC97H細胞相比：* P<0.05 ；與5.0μM API處理的MHCC97H細胞相比：#P<0.05。

2.4 API 抑制MHCC97H 細胞遷移和侵襲能力 如圖4 所示：API（5、10 和20μM）以濃度依賴方式降低MHCC97H 細胞遷移和侵襲率（P<0.05）。

圖4 API劑量依賴性抑制MHCC97H細胞遷移和侵襲（mean±SD，n=3）

2.5 miR-148a-3p 抑制物拮抗API 抑制MHCC97H細胞遷移和侵襲作用 miR-148a-3p 抑制物增強MHCC97H 細胞遷移（圖5 A；P<0.05）和侵襲能力（圖5 B；P<0.05），并且miR-148a-3p 抑制物能消除API 抑制細胞遷移和侵襲作用（圖5 A 和4B；P<0.05）。

圖5 miR-148a-3p抑制物對API抑制MHCC97H細胞遷移和侵襲的影響（mean±SD，n=3）

劃痕法和Transwell 小室法分別測定MHCC97H 細胞遷移（A）和侵襲（B）率。與miR-148-3p 抑制物陰性對照（Anti-Ctrl）轉染的MHCC97H 細胞相比：*P<0.05；與單獨API（20μM）處理的MHCC97H 細胞相比：#P<0.05；與單獨miR-148a-3p 抑制物轉染的MHCC97H細胞相比：$P<0.05。

3 討論

HCC 的高侵襲轉移特性是其致死的主要原因之一［1］。有研究表明，miR-148a 作為癌基因能增加IDH1 R132H 突變的人膠質瘤細胞遷移和侵襲；與此相反，miR-148a 作為抑癌基因有效抑制人胃癌［7］、卵巢癌［8］和非小細胞肺癌［9］，包括HCC［10］細胞增殖、遷移和侵襲能力。與Huang 等報告的結果一致，本文的結果再次證實miR-148a-3p 模擬物有效地降低HCC 細胞遷移率和侵襲率。

API 屬于無基因毒性的飲食黃酮類化合物。Wang等人［11］最近報道API 通過影響microRNA 轉錄本的表達抑制HCC 細胞生長。我們先前的研究證實API 的糖苷類化合物（異牡荊素）具有抑制HCC 腫瘤干樣細胞遷移和侵襲作用［4］，然而，其作用分子機制有待深入研究。在本文的研究中，我們提呈了一種新的API 藥理分子機制認識，即：API 通過上調miR-148a-3p 表達有效地抑制HCC 細胞遷移和侵襲能力。在隨后的研究中，我們擬探討API 以何種方式上調miR-148a-3p 表達以及miR-148a-3p 轉錄后調控何種或哪類靶基因發揮抑制人HCC 遷移和侵襲作用。