熊膽粉的成分、鑒定及應用研究進展

鐘林江,楊俊莉,何勇志,李玉婷,楊安迪

(1.成都大學 藥學院,四川 成都 610106;2.成都大學 食品與生物工程學院,四川 成都 610106)

0 引 言

熊膽粉來源于熊科動物黑熊的干燥膽汁，是我國傳統名貴中藥材[1].現代藥理研究表明，熊膽粉具有清熱解毒、清肝明目以及抗腫瘤等藥理作用[2-3].隨著熊膽類藥材的臨床用量逐漸增大，且與其代用品價格差異巨大，市場上的熊膽粉出現了摻入較便宜的替代品以及投料不足等問題，嚴重影響相應中成藥質量.本文就熊膽粉的臨床應用、化學成分和真偽鑒別3個方面進行綜述，為熊膽粉后續質量標準的提升提供一定參考.

1 熊膽粉的臨床應用

目前，已有153種上市中成藥含有熊膽粉，如熊膽膠囊、熊膽痔靈栓與痰熱清注射液等，其中很多藥已被列為國家中藥保護品種.通過檢索《中國藥典》《新編中成藥合理應用手冊》以及《新編國家中成藥》，剔除其中重復記錄，有45種含熊膽粉的中成藥，其中處方藥有20種，非處方藥A類有25種.內科病癥(19 種) 的熊膽粉中成藥在臨床應用最為廣泛，如治療咳嗽、發熱、肝病、高血壓與心絞痛等；其次為眼科病癥(11種),以外用為主，如治療沙眼、麥粒腫、急性結膜炎與瞼緣炎等；再其次為外科病癥(7種)，如治療瘡瘍熱痛、膽結石與食管癌等；再次為耳鼻喉科病癥(6種)，如治療急慢性咽喉炎與口舌生瘡；其后依次為痔瘡(4種)、消化不良(2種)及婦科疾病(2種).常用含熊膽粉中成藥功效見表1[4-6].

表1 常用含熊膽粉中成藥的功效

2 熊膽粉的化學成分

動物膽的藥效主要與膽汁中的化學成分有關.動物膽汁的化學成分主要包括膽酸類、膽固醇、色素類、磷脂、氨基酸、無機鹽以及微量元素等[7-8].其中，膽汁酸是其主要的活性成分，以去氧膽酸(DCA)為主,不同動物膽汁中主要活性成分見表2，表2中，?；秦i膽酸(THCA)、豬膽酸(HCA)、?；侨パ跄懰?TDCA)、?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)、?；鞘懰?TLCA)、甘氨膽酸(GCA)、?；秦i去氧膽酸(THDCA)、甘氨去氧膽酸(GDCA)、熊去氧膽酸(UDCA)、?；悄懰?TCA)、豬去氧膽酸(HDCA)、膽酸(CA)、?；切苋パ跄懰?TUDCA)、去氧膽酸(DCA)、鵝去氧膽酸(CDCA).

表2 15種動物膽汁中主要活性成分

由表2可知，通過對15種動物膽汁中主要活性成分進行整理，可見其具有一定相似性，其測定方法均以熊去氧膽酸(UDCA)一種成分作為測定指標，檢測指標單一，難以鑒別熊膽樣品確切來源.

3 熊膽粉的鑒別

3.1 DNA鑒別

熊膽粉的傳統鑒別方法主要有手搓、水試、口嘗以及火燒等，但感官指標常因操作者的經驗不同而存在較大差異，難以達到標準化.何永盛等[9]采用TaqMan實時熒光PCR法，檢測黑熊和棕熊的COI的基因，并根據基因設計出特異性檢測引物和探針，在此基礎上建立了一種快速鑒別熊膽粉生物來源的檢測方法.通過兩個引物的結合，完成了膽粉類藥材及其正偽摻雜品的鑒別.許亞春等[10]將DNA 條形碼技術應用于熊膽粉及其混偽品的鑒定研究，對收集的熊膽粉樣品進行DNA 提取以及PCR擴增雙向測序，結果顯示在COI序列建立的NJ樹中，黑熊、棕熊及混偽品各聚為一支，且可以較好地區分開.田娜等[11]基于STR分型原理建立了一種簡單、快捷且可用于動物膽粉類藥材及其摻偽品的通用DNA指紋圖譜鑒別方法，并收集了豬、熊、魚、雞、鴨、牛、羊、鵝與蛇等膽粉樣本，使用篩選獲得的鑒別引物擴增，并進行STR分型獲得DNA指紋圖譜.根據各物種的STR指紋圖譜差異，可進行物種鑒別.作為一種安全便捷可靠的物種鑒定技術，DNA條形碼指紋圖譜上可以同時反映正偽品的信息，可作為市售熊膽粉真偽鑒別的一種輔助手段.同時，該研究建立的DNA條形碼鑒別方法，同樣也可用于其他動物藥材的真偽鑒別和摻混品的檢出.

3.2 顯微鑒別

顯微鏡可用于觀察藥材內部細胞形態及其組織構造，從而大致判定其質地和成分.張麗華等[12]分別取熊膽、豬膽、羊膽和牛膽的粉末于載玻片上，分別滴加甲苯和乙二醇，進行顯微觀察.結果顯示，熊膽粉的顯微特征與豬膽粉、羊膽粉及牛膽粉有一定的區別，可用于提供一定鑒別依據.李炎桂等[13]使用甲苯作為溶媒裝片，分別對貉膽粉、熊膽粉進行顯微觀察，結果顯示，熊膽粉與豹膽粉也有一定差異.

3.3 熒光鑒別

譚文敏[14]取熊膽粉與兔膽粉末，置于紫外光燈下觀察，其中熊膽粉可觀察到黃白色熒光，而兔膽粉未觀察到明顯熒光現象.李炎桂等[13]發現熊膽粉在紫外光燈下觀察到黃白色熒光，而貉膽粉則可觀察到明亮黃綠色熒光.但楊令家等[15]分別置熊膽粉末和狗膽粉末于紫外光燈(波長365nm)下觀察，二者在紫外條件下均有黃白色熒光，結果表明，在紫外條件下顯示黃白色熒光的不止熊膽粉一種膽粉，故熒光鑒別不能作為熊膽粉鑒別依據.

3.4 薄層鑒別

何柯等[16]建立了熊膽粉的薄層鑒別方法.取?；切苋パ跄懰釋φ掌?，加甲醇制成對照品溶液，以乙酸乙酯—正丁醇—冰乙酸—水(40∶30∶15∶15)為展開劑，磷鉬酸溶液為顯色劑，供試品色譜中，與對照品色譜相應位置上，存在相同顏色的斑點.缺熊膽粉的陰性溶液色譜在相應位置處無對應的斑點.李炎桂等[13]對兔膽粉、豬膽粉、豹膽粉與熊膽粉進行了薄層鑒別，均以異辛烷—冰醋酸—異戊醚—正丁醇—水(10∶5∶5∶3∶1)為展開劑，但其展開顯色后，各動物膽粉間差異較小，故薄層鑒別法不能為熊膽粉的鑒別提供可靠依據.

3.5 紅外光譜鑒別

近年來,紅外光譜鑒別逐漸成為中藥質量鑒定的一種重要手段.李政等[17]將天然熊膽粉、人工熊膽粉及?；切苋パ跄懰嵊诟道锶~變換紅外光譜儀上同法繪制紅外吸收光譜圖.結果顯示，3者在1 700～700 cm-1范圍存在特征性區別,為鑒別天然熊膽粉與人工熊膽粉提供了參考.鄢海燕等[18]運用紅外光譜來鑒別熊膽粉、豬膽粉、牛膽粉與雞膽粉，結果顯示，該方法可以鑒別熊膽粉、牛膽粉與豬膽粉，但不能準確區分熊膽粉與雞膽粉.因其雞膽粉與熊膽粉的紅外吸收光譜圖基本一致，熊膽粉的3個主要紅外吸收特征雞膽粉圖譜中均有.

3.6 近紅外光譜鑒別

隨著儀器分析技術的發展，近年來熊膽粉質量控制及真偽鑒別技術也出現了快速分析的方法.李文龍等[19-20]采用近紅外漫反射光譜法建立了一種熊膽粉提取物中熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸定量預測模型，鑒別了熊膽粉的真偽.并對其摻偽品的摻入比例做了定量分析，對采集到的結果進行主成分分析，結果表明，熊膽粉及其摻偽品之間存在明顯界限，不同來源地的熊膽粉之間存在著一定的差異.程志偉[21]采用近紅外光譜分析技術，建立了熊膽粉水解過程中4種膽汁酸(?；切苋パ跄懰?、?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸以及鵝去氧膽酸)含量的快速測定方法，適用于大規模與批量生產的質量控制，同時將近紅外光譜分析技術與移動窗標準偏差法相結合，提出了一種快速有效的熊膽粉水解過程終點判斷方法，為其他動物藥的水解過程質量控制提供了新思路.與傳統的分析技術相比，近紅外光譜技術具有高效、在線檢測、無損分析與多通道數據傳輸等優點，對于實現中藥生產智能化以及規范化有著重大意義.

3.7 氨基酸和微量元素含量鑒別

氨基酸和微量元素是與機體生命活動息息相關的重要物質，其中重金屬元素為中藥進出口檢測的重要指標之一.因此，對熊膽粉中氨基酸和微量元素的含量進行測定，可用于熊膽粉的鑒別.李菲[22]用氨基酸分析儀和原子分光光度計等儀器分別測定熊膽粉、鵝膽粉、雞膽粉與鴨膽粉中氨基酸及微量元素的含量，發現4種膽粉中游離氨基酸的含量均較低，水解氨基酸的含量從小到大依次為熊膽粉、雞膽粉、 鵝膽粉與鴨膽粉，4種膽粉均含有18 種中無機元素，其中磷、鉀、鈣、鎂與鈉的含有量較高，且熊膽粉中含量低于其他膽粉.王杰等[23]利用液相色譜與質譜聯用技術測定不同來源地(四川、云南與黑龍江)熊膽粉的膽汁酸和氨基酸，并利用電感耦合等離子體質譜儀測定其微量元素.結果表明，不同來源熊膽粉中氨基酸與微量元素含量也存在著一定的差異，為熊膽粉的鑒別提供了一定的科學依據.

3.8 特征圖譜鑒別

熊膽粉現行的質量標準大多采用紫外檢測器測定其膽汁酸含量，但其膽甾烷結構僅有極其微弱的紫外末端吸收，靈敏度差[24-25].蒸發光散射檢測器是目前廣泛應用的膽汁酸成分檢測器，彌補了紫外檢測器基線漂移與靈敏度差等一系列問題[26-28]，但蒸發光散射檢測器在精密度等方面仍具有一定局限性[29-31].由于熊膽粉成分復雜，單采用高效液相色譜法難以將其大多數成分洗脫出來,目前未見有相關研究僅利用高效液相色譜法建立熊膽粉所有成分的特征指紋圖譜.簡龍海等[32]運用高效液相色譜法只針對痰熱清注射液中熊膽粉部分的指紋圖譜進行了測定，并定量測定了熊去氧膽酸與鵝去氧膽酸.張怡欣等[33]首次采用超高效液相色譜串聯電噴霧式檢測器新技術，對熊膽粉中膽汁酸成分進行了分析，建立了熊膽粉的特征指紋圖譜，并對不同來源熊膽粉進行了相似度評價以及差異性化學成分分析，解決了熊膽粉現行質量控制模式存在的膽汁酸類化合物信息不足、檢測困難以及耗時長等問題，為熊膽粉的鑒別提供了新的思路和方法.

4 結 語

中藥材的研究熱點主要集中在化學成分分析及其藥理作用研究方面[34]，大部分中藥材的鑒定方法并不完善，還有待進一步研究.熊膽粉的主要活性成分熊去氧膽酸可通過人工合成途徑獲得，一定程度上為其替代品提供了可能性，但有研究表明，熊膽粉的功效在于其熊去氧膽酸與其他多種成分的協同作用，人工合成熊去氧膽酸難以完全替代其療效.為確保熊膽粉中成藥的功效，有必要建立鑒別熊膽粉樣品確切來源的檢測方法.目前，熊膽粉常用的鑒別方法為性狀鑒別、顯微鑒別及薄層鑒別等，存在一定主觀因素,不能滿足現代中成藥的生產需求，如采用薄層鑒別法比較其成分差異，具體這種成分的差異，是否會導致兩者在其藥理作用的差異，有待進一步探討.

熊膽粉與其他動物膽粉具有相似的化學組成，但其形成機理和環境不同，在一定程度上必然存在差異，可采用超高效液相色譜聯合飛行時間串聯質譜技術并結合多元統計分析軟件分析熊膽粉及其他膽粉的化學成分[35-36]，從而發現其專屬性特征成分，準確鑒別并控制其質量，全面提升熊膽粉中成藥的質量標準.后期可借助光譜、氣/液色譜、質譜以及相關聯用技術，研究傳統名貴中藥材的特征圖譜.同時，可借助DNA條形碼、PCR 擴增及譜—效等分子生物學技術，開展其特異性成分的定性鑒別及定量研究，以提高其質量標準.