黃芪/淫羊藿多糖微針制備及免疫效果分析

張學柏 蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州 730050

微針作為一種新型的經皮免疫技術，具有高效、無痛、安全的特點，能打破角質層對藥物的阻滯作用，提高遞送效率，可用于疫苗遞送[1-2]。微針可分為固體微針、涂布微針、中空微針和可溶性微針。其中可溶性微針的制備材料具有生物相容性的優點，當可溶性微針刺入皮膚后針體可以溶解在組織中也不會給皮膚增加負擔?？扇苄晕⑨樢泊嬖诹W性能較差等問題[3]。目前，可溶性微針的制備方法有兩種，一種方法是將基質溶化與所需藥物一起倒入模具中，將模具置于真空條件下，在一定溫度下持續一定時間，干燥后即可得到載藥的可降解微針，另一種方法是將藥物和基質加入溶劑中，蒸發除去部分溶劑后，澆入模具中，高速離心，使藥物和基質充分填滿模具的空間，采用適當的干燥條件干燥使其慢慢固化，脫模即成[4]。

研究采用真空法制備聚乙烯吡咯烷酮（PVP）/黃芪多糖微針和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）/淫羊藿多糖微針，通過對其成型性、機械強度和免疫效果進行分析，以期制備出以中藥多糖為主要材料的微針。

1 試驗與方法

1.1 試劑與儀器

黃芪/淫羊藿，甘肅蘭州黃河中藥材市場；聚乙烯吡咯烷酮（分析純），合肥巴斯夫生物科技有限公司；蔗糖（分析純），沈陽市新化試劑廠；吉林五星寵安士佳4聯疫苗，飄揚貓咪寵物醫院；Vero細胞，賽默飛世爾科技有限公司；所有其他化學品均為分析級，無需進一步純化。SD大鼠，雄性，180 g-220 g，SPF級，購自蘭州大學實驗動物中心

恒溫水浴鍋（B-220型），上海亞榮生化儀器廠；磁力攪拌器（ZF-7），江蘇省金壇市醫療儀器廠；光學顯微鏡（XSP-3CB），上海光學儀器一廠；體式顯微鏡（Stemi305），北京普瑞賽司儀器有限公司；真空干燥箱（DZF-6020），上海一恒科學儀器有限公司；拉力機（SMT-5000），揚州市賽思檢測設備有限公司；冷凍干燥機(FD-1A-50)，北京博醫康實驗儀器有限公司；酶標分析儀（DNM9206A），北京普朗新技術有限公司。

1.2 黃芪多糖/淫羊藿多糖的提取

分別稱取處理的黃芪根莖和淫羊藿莖葉置于燒杯中，在燒杯中加入80%乙醇（料液比1:10），80 ℃條件下，水浴加熱脫脂三次，每次3h。用四層醫用紗布將醇提液過濾掉，留下藥渣，將脫脂后的藥渣放入恒溫干燥箱中干燥。干燥好的藥渣繼續加入圓底燒杯中，并添加蒸餾水（料液比為1:10），在80℃下水浴提取三次，每次3h[5]。三次的提取液合并在4000 r/min轉速下離心10 min，除去底部沉淀后，將上清液繼續合并在一起，用旋轉蒸發儀進行濃縮至一定體積，將濃縮液放置室溫，用Sevage法除蛋白，蛋白除完全后，將濃縮液置于透析袋中進行透析，時間為3d，每24h更換一次去離子水，透析結束后將提前冷凍好的溶液放入冷凍干燥箱中冷凍干燥48h，最終得到初步純化的淫羊藿和黃芪多糖。

1.3 黃芪/淫羊藿多糖微針的制備及形態觀察

分別配置2%的黃芪/淫羊藿多糖溶液，25% PVP溶液，分別以黃芪/淫羊藿多糖溶液與PVP溶液體積比為1:1制備成混合溶液，并在混合溶液中添加0.15 g蔗糖。使用真空法，在室溫干燥的條件下制備黃芪/淫羊藿多糖微針，然后將黃芪多糖制備的可溶性微針命名為HQ-1，淫羊藿多糖制備的命名為YYH-1，使用光學顯微鏡和體視顯微鏡觀察微針的形態。

1.4 黃芪/淫羊藿多糖微針的機械強度測定

使用拉力機測定微針的機械強度，分別將HQ-1，YYH-1針尖朝上放在下壓頭上，設置移動速度為1 mm/min，測定不同比例下黃芪多糖微針的最大斷裂力度，選出具有最大機械強度的黃芪多糖微針，拉力機的力與位移會被記錄在電腦上，每個樣品測試三次。

1.5 黃芪/淫羊藿多糖微針的免疫效果試驗

1.5.1 負載犬四聯疫苗的兩種多糖微針的制備本次購買的疫苗是犬疫苗，需將狗的藥用量換算成大鼠的藥用量。因此，采用動物的體表面積計算法Meeh-Rubner氏公式進行換算[6]：

A:體表面積[m2]；K:常數，K狗為11.2，K大鼠為9.1；W：體重[g]

稱取適量犬四聯疫苗粉末分別溶于提前制備好的兩種多糖混合液中混勻。用真空法制備微針，由于犬四聯疫苗的最適溫度為2–8℃，因此用真空法制備好微針后將微針放入4℃硅膠盒中干燥，干燥結束后取出，即得負載犬四聯疫苗的黃芪/淫羊藿多糖微針，記為QHQ-1和QYH-1，制備三組。

1.5.2 兩種多糖微針的免疫效果試驗

試驗采用SD雄性大鼠作為免疫效果評價的動物模型。首先，對SD大鼠腹腔注射10%的水合氯醛溶液（0.3 mL/100 g）進行術前麻醉、固定，并用苦味酸進行標記。麻醉扎針時應有落空感，回抽時無尿液或血液[7]。給大鼠背部剃毛并用75%酒精消毒，將制備好的HQ-1、YYH-1、QHQ-1、QYH-1分別用大拇指按壓1min，并用無菌紗布及彈性繃帶包扎，處理結束后將老鼠放入籠中觀察[8]。

將犬四聯疫苗干粉溶于PBS溶液中，攪拌均勻，對大鼠皮下注射。其中陽性對照組為皮下注，陰性對照組為HQ-1，空白對照組為不做任何處理的健康大鼠。初次免疫時間10d后對大鼠進行眼眶取血，分離血清，存入-20℃冰箱中。繼續重復初次免疫的操作步驟，進行二次免疫，20d后對大鼠進行眼眶取血，分離血清，存入-20℃冰箱中。

犬四聯疫苗中包含犬瘟、細小、犬副流感、犬腺病毒四種，本實驗選用犬四聯疫苗中的犬副流感作為檢測對象來檢測大鼠體內的免疫效果。

1.6 細胞毒性檢測

分別配置淫羊藿多糖溶液，黃芪多糖溶液，PVP溶液，蔗糖溶液（每種溶液設置低，中，高三個濃度），分別記為Y-1、Y-2、Y-3、H-1、H-2、H-3、Z-1、Z-2、Z-3、P-1、P-2、P-3。

非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）的復蘇：Vero細胞活化后，加入DMEM培養基，置于37℃二氧化碳培養箱中培養[9]。本實驗采用MTT法檢測細胞毒性[10]。

2 結果與討論

2.1 微針的形態觀察

通過在顯微鏡下觀察制備的兩種多糖微針，可以看到微針成四棱錐型，其中每個微針的針長為550 μm，針體底部尺寸為250×250 μm，相鄰每兩個針的針尖距離為600 μm，每個微針陣列的針體數目是225個，微針背襯部面積為9.5×9.5mm。并且微針的形態完整均一，微針的背襯部具有適當的厚度和柔軟性。

2.2 機械強度分析

通過拉力機來測定微針的機械強度見圖1。由力與位移的受力圖可知，制備的微針具有一定的抗壓性能，隨著位移的增加，所受的力也呈現上升趨勢，當微針完全破碎時，曲線會出現一個拐點，該點的力即為微針所能承受的最大壓力，隨后曲線呈直線上升。其中HQ-1的最大受力為768 N, YYH-1能承受的最大壓力為676 N，這表明所制備的微針具有一定的機械強度，可以用于微針疫苗。

圖1 黃芪多糖微針圖（a）和淫羊藿多糖微針圖（b）的機械強度圖

2.3 免疫效果評價與分析

通過酶聯免疫間接法對微針進行免疫效果的定性檢測，分別是QYH-1組，QHQ-1組，皮下注射組，HQ-1組，健康大鼠組，試劑盒中的陽性對照和陰性對照。結果顯示HQ-1組與健康大鼠組兩次免疫后測得血清的OD值幾乎沒有變化，均小于0.343，PIV-Ab呈陰性。QYH-1組，QHQ-1組和皮下注射組初次免疫后各有一組血清的OD值大于0.343，PIV-Ab呈陽性，且QYH-1組和QHQ-1組測得血清的OD值略高于皮下注射組血清的OD值。二次免疫后QYH-1組和QHQ-1組的血清OD值均大于0.343，PIV–Ab呈陽性，并且OD值明顯高于皮下注射組。這表明QYH-1和QHQ-1使大鼠產生了免疫應答，并且免疫效果高于皮下注射。黃芪多糖，淫羊藿多糖具有免疫增強作用，可能起到了佐劑的功效，這為黃芪多糖和淫羊藿多糖作為佐劑應用在微針疫苗中提供了可能性。

2.4 細胞毒性結果分析

培養72 h后，H-1，H-2，H-3，Y-1，Y-2，Y-3，Z-1，Z-2，Z-3，P-1，P-2，P-3對應的細胞存活率分別為100.84±12.94%，69.94±15.87%，76.58±11.20%，65.9±15.14%，54.66 ±8.77%，217.12 ±38.15%，141.72±16.99%，126.7±20.92%，84.4 8 ±20.95%，290.5±42.87%，243.28±39.17%，1 47.32±21.86%，其中H-2，Y-1，Y-2的細胞存活率在50%～75%的范圍內。根據細胞毒性的評級劃分2級，結合細胞形態進行評價后，判為合格，其余的微針材料溶液根據細胞毒性的評級劃分0級或1級，判為合格。根據黃芪多糖，淫羊藿多糖，PVP，蔗糖溶液的低、中、高濃度的細胞毒性測量結果顯示，此次制備的黃芪多糖微針和淫羊藿多糖微針的水溶性材料無細胞毒性。

結語

淫羊藿多糖微針，其具有適當的機械強度和生物相容性，可以在大鼠體內產生免疫應答。目前，市場上沒有黃芪多糖和淫羊藿多糖作為佐劑用于微針疫苗，研究對中藥多糖作為輔料兼佐劑用于微針疫苗及對微針疫苗的開發具有啟發意義。