神經酰胺脂質體對靈芝發酵液中大分子極性成分的經皮遞送效果研究

湯清涵,高潔,董潔,張啟清，陳軍

(1.南京中醫藥大學藥學院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中醫外用藥開發與應用工程研究中心,江蘇 南京 210023；3.上海潔士寶日化集團有限公司，上海 201400)

靈芝(Ganoderma lucidum)是我國的傳統中藥,是一種藥食兩用大型真菌,不僅具有極高的藥用價值,還具有良好的美容護膚功效[1-2]。靈芝發酵液(Ganoderma lucidum fermentative liquid,GLFL)中含有蛋白多肽、多糖等多種活性成分,具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、美白、保濕等護膚功效,將其作為功效成分添加在化妝品中正在成為產品開發的熱點[3-4]。然而,GLFL中主要活性物質多具有較強的親水性以及較大的相對分子質量,從而不易穿過皮膚角質層屏障,皮膚滲透性差,功效得不到充分發揮,是限制其實際應用的瓶頸問題。

神經酰胺脂質體(Cerosomes,CS)是一種新型皮膚局部給藥載體,是由磷脂、神經酰胺、膽固醇等組成的具有類脂雙分子層結構的脂質體,具有優良的穩定性和皮膚耐受性[5-6]。研究表明,在脂質體雙分子層中加入神經酰胺可以顯著影響脂質體的經皮遞送效果,與普通脂質體(Conventional liposomes,CL)相比,CS能夠顯著促進藥物的經皮滲透[7-8]。

本文選用水溶性大分子熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖(Fluorescein isothiocyanate-dextran,FD)作為熒光探針,摻入GLFL中制成FD-GLFL-CS,以考察加入神經酰胺對于脂質體經皮遞送效果的影響及其機制,為提高極性大分子的經皮遞送效果提供制劑技術。

1 材料

RE-52A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);DZF-6020真空干燥箱(上海精宏儀器設備有限公司);Zetasizer Nano ZS90激光散射粒徑測定儀(英國馬爾文儀器有限公司);JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機(浙江寧波新芝生物科技股份有限公司);S-4800掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司);HH-4數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);TK-24BL透皮擴散試驗儀(上海鍇鎧儀器設備有限公司);LS55熒光分光光度計(美國PerkinElmer公司);DSC200F3差示掃描量熱儀(德國NETZSCH公司);Axio Scope. A1正置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司);VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司)。

靈芝發酵液(批號:20200710,上海潔士寶日化集團有限公司);大豆磷脂(批號:SY-SI-190602,上海艾偉拓醫藥科技有限公司);膽固醇(批號:B80859,上海艾偉拓醫藥科技有限公司);油溶性神經酰胺3(批號:201901219,韓國斗山集團);吐溫80(化學純,批號:20190220,上海國藥集團);BCA試劑盒(批號:20190910,北京索萊寶科技有限公司);FD(分子量:4 000,批號:46955-500MG-F,美國Sigma公司);其它試劑均為市售分析純。

雄性SD大鼠,SPF級,體質量(200±20)g,購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司,合格證號:SCXK(浙)2019-0001。

2 方法

2.1 FD-GLFL脂質體的體外經皮遞送研究

2.1.1 FD-GLFL脂質體的制備 采用薄膜分散法制備FD-GLFL脂質體。將2.5 mg FD溶解在5 mL GLFL中得到FD-GLFL，按表1稱取處方量大豆磷脂、膽固醇、神經酰胺3，加入5 mL乙醇超聲溶解，轉移至250 mL茄形瓶中，40 ℃減壓旋轉蒸發30 min除去有機溶劑至瓶壁形成一層均勻的薄膜后，繼續真空旋蒸除盡剩余溶劑，真空干燥過夜，加入5 mL FD-GLFL溶液(含0.5 mg·mL-1FD，0.5%吐溫80)水合1 h，得到FD-GLFL-CS[C/S(1∶12)、C/S(1∶6)、C/S(1∶3)]混懸液。同法不加神經酰胺3制成FD-GLFL-CL混懸液。冰水浴條件下探頭超聲4次(功率60 W，工作2 s，暫停2 s)，即得分散均勻的脂質體，置于4 ℃保存。

表1 FD-GLFL脂質體的處方

2.1.2 體外經皮遞送實驗 取2.1.1項下制備的各處方FD-GLFL脂質體，高速離心(4 ℃，20 000 r·min-1，45 min)分離脂質體與游離FD，沉淀用GLFL復溶，得到除去游離FD的各組FD-GLFL脂質體樣品。取雄性SD大鼠，麻醉后除去腹部毛發，脫頸處死，剪下無損傷的腹部皮膚，剔除皮下脂肪組織，浸于生理鹽水中洗凈。將大鼠皮膚角質層朝上固定于透皮擴散池(有效擴散面積3.14 cm2)，接收池內加入8.3 mL PBS(pH 7.4)作為接收液，供給室內加入1 mL各組FD-GLFL脂質體樣品(FD濃度為25 μg·mL-1)，于37 ℃，以400 r·min-1的速度磁力攪拌，避光作用12 h。結束后，取下皮膚，溫水清洗、除凈表面殘留制劑，剪下有效給藥部位并剪碎，用甲醇/水(體積比1∶1)提取皮內藥物12 h，4 500 r·min-1離心10 min，取上清液過0.45 μm濾膜，以熒光分光光度法(激發波長485 nm，發射波長520 nm)測定皮內藥物濃度[F=0.73C+50.16，r2=0.999 4，標準曲線以甲醇/水(體積比1∶1)配制]，計算12 h的皮內滯留量。

2.1.3 熒光顯微鏡法觀察皮內藥物分布 將大鼠皮膚固定于透皮擴散池,于供給室內分別加入1 mL的FD-GLFL,FD-GLFL-CL和C/S(1∶6)(FD濃度均為25 μg·mL-1),按2.1.2項下方法進行體外經皮遞送實驗。給藥12 h后,從皮膚表面吸除多余的制劑,并用溫水洗凈皮膚,將有效給藥部位的皮膚剪下,固定于冷凍包埋劑中,制備冷凍切片,在熒光顯微鏡下觀察皮膚內藥物分布。

2.2 GLFL-CS的制備

根據體外遞送實驗優選處方，采用薄膜分散法制備GLFL-CS。精密稱取大豆磷脂120 mg,膽固醇15 mg和神經酰胺3 20 mg,用適量乙醇超聲溶解,并轉移至250 mL茄形瓶中,40 ℃減壓旋轉蒸發除去有機溶劑至瓶壁上形成一層薄膜,放入真空干燥箱過夜除去痕量溶劑,加入5 mL GLFL(含0.5%吐溫80)水合1 h,于冰浴條件下探頭超聲4次(功率60 W,工作2 s,暫停2 s),即得GLFL-CS,置于4 ℃保存。以PBS緩沖液代替GLFL,處方中其他輔料的用量不變,同上法制備空白CS。

2.3 GLFL-CS的理化性質考察

2.3.1 GLFL-CS的形態觀察與粒徑測定 吸取GLFL-CS加水適當稀釋后,均勻黏附于硅片上,置于樣品池中,表面減壓噴金處理,于掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察其形態。吸取GLFL-CS 100 μL,加水稀釋到1 mL,混合均勻,采用激光散射粒徑測定儀測定其粒徑和粒徑分布(PDI)。

2.3.2 GLFL-CS的包封率測定 采用離心沉淀-離心超濾法測定GLFL-CS的蛋白多肽類成分的包封率。吸取GLFL-CS和空白CS適量,4 ℃,20 000 r·min-1離心30 min,取上清液加入超濾管中(截留分子量為100 kDa),配平,4 ℃,14 000 r·min-1離心10 min,分離得到游離的蛋白多肽。BCA法測定GLFL-CS中游離的多肽濃度Cf,空白CS的游離濃度Ck以及GLFL中總多肽濃度Ct,計算包封率,包封率=1-(Cf-Ck)/Ct×100%。

2.3.3 GLFL-CS的穩定性考察 制備GLFL-CS,置4 ℃冰箱儲存,分別于0、3、7、10、14 d測定脂質體粒徑與包封率的變化。

2.4 ATR-FTIR法研究GLFL-CS的經皮遞送機制

將大鼠皮膚固定于透皮擴散池,于供給室內分別加入1 mL的GLFL、GLFL-CL和GLFL-CS,按“2.1.2”項下方法進行體外經皮遞送實驗。給藥12 h后取下皮膚,表面用純水洗滌干凈,并用濾紙吸干水分,采用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)對皮膚樣品進行掃描。ATR-FTIR實驗條件:掃描次數為64次,分辨率為1 cm-1,掃描范圍為400～4 000 cm-1。

3 結果

3.1 FD-GLFL-CS的體外經皮遞送效果

3.1.1 神經酰胺對脂質體經皮遞送效果的影響 以FD-GLFL和FD-GLFL-CL作為對照,研究神經酰胺加入量對脂質體體外經皮遞送效果的影響。如圖1所示,12 h后皮膚中藥物滯留量順序為: C/S(1∶6)>C/S(1∶12)>C/S(1∶3)>FD-GLFL-CL>FD-GLFL,FD-GLFL-CS[即C/S(1∶3)、C/S(1∶6)、C/S(1∶12)]組的皮內滯留量均大于FD-GLFL組和FD-GLFL-CL組,且以C/S(1∶6)的皮內滯留量最高,分別為FD-GLFL及FD-GLFL-CL的2.87倍和1.78倍。

注：與FD-GLFL比較,圖1 神經酰胺對脂質體體外經皮遞送效果的影響Fig. 1 Effect of ceramide on transdermal delivery of liposomes in vitro

3.1.2 熒光顯微鏡法觀察皮內藥物分布 不同FD-GLFL脂質體給藥后的皮膚熒光顯微鏡圖結果見圖2,可見給藥12 h后,皮內FD總熒光從弱到強依次為:FD-GLFL、FD-GLFL-CL、FD-GLFL-CS[C/S(1∶6)],與上述皮內滯留量的定量結果一致。從皮內分布可知,FD-GLFL和FD-GLFL-CL處理后的皮膚FD熒光主要分布在最外層的角質層,少量分布在毛囊中,FD-GLFL-CL在皮膚深層也有少量分布;FD-GLFL-CS[C/S(1∶6)]處理后的皮膚FD熒光在角質層和深層都有大量分布。由此可見,CS可能與皮膚具有較強的親和力,降低了皮膚的屏障作用,促進更多的藥物向皮膚深層滲透[9-10]。

圖2 FD-GLFL及其脂質體給藥后的皮膚熒光顯微鏡圖Fig. 2 Fluorescence microscopy of skin after the administration of FD-GLFL and its lipidosomes

3.2 GLFL-CS的理化性質

3.2.1 GLFL-CS的外觀形態、粒徑與包封率 采用掃描電鏡(SEM)觀察GLFL-CS形態結構,結果如圖3所示,GLFL-CS呈類球形,平均粒徑為(259.3±16.7)nm,PDI為(0.29±0.03)。前期研究顯示GLFL中蛋白多肽為主要成分,因此測定蛋白多肽類成分的包封率,為GLFL-CS的質量評價提供依據,測得包封率為(43.03±0.90)%。

圖3 GLFL-CS的掃描電鏡圖(×60 000)Fig. 3 Scanning electron microscope pictures of GLFL-CS (×60 000)

3.2.2 GLFL-CS的穩定性 通過考察GLFL-CS在4 ℃下貯存14 d過程中,粒徑和包封率的變化來評價脂質體的穩定性。粒徑和包封率的變化測定結果如圖4所示,在14 d內,粒徑及包封率幾乎均未發生明顯變化,表明GLFL-CS在4 ℃下貯存穩定性較好。

圖4 GLFL-CS 14 d內粒徑與包封率變化Fig. 4 Changes of particle size and encapsulation ratio of GLFL-CS during 14 d

3.2.3 GLFL-CS的經皮遞送機制 應用ATR-FTIR技術檢測GLFL-CS作用于大鼠皮膚后角質層脂質和角蛋白的主要特征峰位移及峰面積的變化[11],以判斷角質層結構的變化,闡明CS促進GLFL中水溶性大分子成分經皮滲透的機制。皮膚ATR-FTIR圖譜如圖5所示。

GLFL、GLFL-CL和GLFL-CS作用于皮膚后,角質層OH振動峰分別為3 279.43、3 283.21、3 288.10 cm-1,與GLFL相比,GLFL-CL和GLFL-CS的OH振動峰均向高峰位移動,且峰面積增大,說明脂質體可使角質層水合作用加強,且作用強度排序為GLFL-CS>GLFL-CL>GLFL。

角質層細胞間脂質通路是藥物進入皮膚的重要途徑,脂質特征峰(CH2非對稱振動峰和對稱振動峰)的變化與其組成結構直接相關。GLFL、GLFL-CL和GLFL-CS作用后,CH2非對稱振動峰和對稱振動峰分別為2 916.58 cm-1和2 849.64 cm-1,2 924.82 cm-1和2 852.73 cm-1,2 924.56 cm-1和2 851.19 cm-1,與GLFL相比,GLFL-CL和GLFL-CS的脂質特征峰皆向高峰位移動,且峰面積皆減小,表明脂質體使得角質層脂質的組成結構發生了很大的改變,更利于藥物的經皮滲透。

此外,我們還發現脂質體的干預使皮膚角蛋白的結構或構象也發生了變化,GLFL、GLFL-CL和GLFL-CS作用后,NH—C=O的振動Ⅰ峰和振動Ⅱ峰分別為1 641.61 cm-1和1 542.40 cm-1,1 633.03 cm-1和1 549.95 cm-1,1 630.03 cm-1和1 552.27 cm-1,與GLFL相比,GLFL-CL和GLFL-CS的振動Ⅰ峰均向低峰位移動以及振動Ⅱ峰向高峰位移動,且峰面積均略有增大,2組峰作用強度順序均為GLFL-CS>GLFL-CL>GLFL。

CS可能是通過增強皮膚角質層水合作用及改變角質層脂質和角蛋白的結構或構象,增加角質層脂質雙分子層的流動性,降低皮膚屏障作用,從而促進了藥物的經皮滲透。

注：A.GLFL;B.GLFL-CL;C.GLFL-CS圖5 CS對大鼠皮膚角質層ATR-FTIR圖譜的影響Fig. 5 Effects of CS on ATR-FTIR spectra on rat skin cuticle

4 討論

本文針對中藥水溶性大分子成分難以有效遞送入皮膚這一問題,將GLFL載入CS中,并對該載體的體外經皮遞送效果及機制進行研究,以期為GLFL皮膚外用制劑與化妝品的開發提供研究基礎。研究結果表明,與GLFL溶液和GLFL-CL相比,GLFL-CS可以顯著提高水溶性大分子物質的皮內滯留量和透皮深度,有望成為新型經皮局部給藥載體。

藥物自身的理化性質影響脂質體的包封率,采用常用的脂質體制備方法(薄膜分散法、逆相蒸發法、乙醇注入法)制備載親水性大分子成分的脂質體,包封率一般較低[12]。本文采用薄膜分散法制備了GLFL-CS,主成分蛋白多肽的包封率為(43.03±0.90)%。后續研究表明,CS可以促進游離水溶性大分子物質的經皮滲透,包封率可能不是增強藥物皮膚滲透性的重要因素。這可能在一定程度上避免了親水性大分子物質脂質體包封率普遍偏低以及制備工藝復雜等問題,CS有望推動水溶性成分在外用制劑及化妝品等領域的有效應用。