薄芝糖肽聯合順鉑對食管鱗狀細胞癌細胞增殖凋亡及相關信號通路的影響

薛曉婕，李飛容，孫秋萍

1鄂東醫療集團黃石市中心醫院(湖北理工學院附屬醫院)檢驗科，湖北黃石435000；2腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室；3武漢科技大學醫學院;4鄂東醫療集團黃石市中心醫院(湖北理工學院附屬醫院)

食管癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，具有發病率高、侵襲性強、病死率高等特點[1]。目前食管癌的治療方式包括手術、放療和化療，而傳統抗腫瘤藥物如順鉑等因選擇性差易引起較嚴重的不良反應，如何減少化療藥物不良反應是目前亟待解決的難題[2-3]。薄芝糖肽(GCGP)是從靈芝屬薄樹芝的干燥菌絲體粉末中提取而成，具有護肝、抗炎、免疫調節及輔助抗腫瘤等多種作用。研究顯示，其對機體非特異性免疫、體液免疫及細胞免疫等均有促進作用，同時具有抗氧化、清除氧自由基的作用，且成分穩定，不良反應少[4]。鱗狀細胞癌是食管癌的主要組織學類型，目前關于GCGP聯合順鉑對食管鱗狀細胞癌的抑制作用及其機制的相關研究較少。促分裂原活化的蛋白激酶/細胞外調節蛋白激酶(MAPK/ERK)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路是將胞外信號傳遞到細胞核內最重要的信號通路，在調控細胞增殖分化、血管生成和代謝等功能中起關鍵作用。2019年10月—2021年4月，我們通過體外培養食管鱗狀細胞癌Eca-109細胞，觀察GCGP聯合順鉑對其增殖和凋亡的影響，并探討其作用機制與MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路的關系，旨在為臨床治療食管癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 Eca-109細胞株購于中科院上海細胞所。GCGP注射液(北京賽升藥業股份有限公司)，順鉑(美國Sigma-Aldrich公司)，胎牛血清、RPMI1640完全培養基(美國Gibco公司)，青霉素—鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶(北京索來寶科技有限公司)，四氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)，MAPK/ERK信號通路調控蛋白胰島素樣生長因子結合蛋白4(IGFBP-4)、妊娠相關血漿蛋白A(PAPP-A)、ERK及PI3K/Akt信號通路調控蛋白尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)、Akt一抗(美國Sigma公司)，β-actin二抗、細胞裂解液、PVDF膜(上海碧云天生物技術有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo)，FITC和PI(美國Sigma公司)，GAPDH(美國Santa Cruz公司)。CO2飽和濕度細胞培養箱(美國賽默飛公司)；酶標儀(美國賽默飛公司),倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細胞儀(美國Beckman公司)，SDS-PAGE電泳儀(美國Bio-rad公司)。

1.2 細胞培養 取Eca-109細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素—鏈霉素混合液的RPMI1640完全培養基中，置于5% CO2飽和濕度細胞培養箱中培養，每2～3 d傳代1次。

1.3 GCGP與順鉑最佳作用濃度及最佳作用時間的篩選 采用MTT法。取對數生長期細胞，加入胰酶進行消化，用DMEM培養液配置成單細胞懸液，按3×104/孔接種于96孔培養板，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24 h。棄培養液，分別加入50、100、200 mg/L GCGP溶液2 mL，再加入100 ng/mL順鉑2 mL，置于培養箱中繼續培養。培養24、48、72 h后，每孔分別加入5 mg/mL MTT 10 μL，繼續培養4 h，吸去上清液，加入150 μL DMSO溶液，振蕩培養10 min。上酶標儀，于波長490 nm處檢測光密度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。根據細胞存活率繪制細胞增殖抑制曲線。結果顯示，GCGP和順鉑對Eca-109細胞均具有毒性作用，100 mg/L GCGP作用48 h時的IC50為54.9%；以100 mg/L GCGP聯合100 ng/mL順鉑作用48 h時的IC50為44.1%。因此選擇100 mg/L GCGP聯合100 ng/mL順鉑作用48 h作為最佳作用濃度和最佳作用時間。

1.4 細胞增殖能力觀察 采用細胞克隆形成實驗。取對數生長期細胞，按3×105/孔接種于6孔培養板。待細胞貼壁后，將細胞分為對照組、GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組，對照組正常培養，GCGP組加入100 mg/L GCGP，順鉑組加入100 ng/mL順鉑，GCGP+順鉑組加入100 mg/L GCGP和100 ng/mL順鉑，各組繼續培養48 h。去除含藥培養基，加入2 mL新鮮培養基繼續培養，直到形成肉眼可見的細胞集落方可終止培養。PBS清洗細胞，加入多聚甲醛固定20 min，PBS清洗。顯微鏡下拍照，用Image J軟件分析細胞克隆數目。細胞集落形成率(%)=(實驗組細胞集落形成數/對照組細胞集落形成數)×100%。

1.5 細胞凋亡率檢測 取對數生長期細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養液制成細胞懸液，按3×105/孔接種于6孔培養板。將細胞分為對照組、GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組，對照組正常培養，GCGP組加入100 mg/L GCGP，順鉑組加入100 ng/mL順鉑，GCGP+順鉑組加入100 mg/L GCGP和100 ng/mL順鉑，繼續培養48 h。上流式細胞儀，用488 nm激光激發和530 nm發射濾光片檢測細胞凋亡率，采用Flow J軟件進行分析。

1.6 細胞PAPP-A、IGFBP-4、uPA、ERK、Akt蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集培養48 h的四組細胞，1 500 r/min離心5 min，加入細胞裂解液吹打均勻，4 ℃振搖30 min。收集細胞裂解液于EP管中，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，用BCA法行蛋白定量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別與鼠抗人PAPP-A、IGFBP-4、uPA、ERK和Akt單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，HRP標記熒光抗鼠二抗1∶5 000室溫避光孵育2 h，洗滌3次，每次10 min，將PVDF膜置于化學反應液中5 min進行顯色，取出洗凈膜，將其放置熒光化學發光圖像分析儀中進行曝光，采用Image J 圖像軟件對結果進行分析。以目的蛋白與內參β-actin蛋白的比值表示目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 四組細胞增殖能力比較 對照組、GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組的細胞集落形成率分別為100%、57.2%±4.2%、43.8%±5.1%、11.9%±3.6%。與對照組比較，GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組細胞集落形成率均降低，且GCGP+順鉑組細胞集落形成率低于GCGP組和順鉑組(P均<0.01)。

2.2 四組細胞凋亡率比較 對照組、GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組的細胞凋亡率分別為1.3%±0.8%、22.5%±3.8%、38.7%±4.2%、61.6%±5.9%。與對照組比較，GCGP組、順鉑組、GCGP+順鉑組細胞凋亡率均升高，且GCGP+順鉑組細胞凋亡率高于GCGP組和順鉑組(P<0.05或<0.01)。

2.3 四組細胞PAPP-A、uPA、IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表達水平比較 與對照組比較，GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組中PAPP-A、uPA蛋白表達均降低，IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表達均升高(P<0.05或<0.01)，與GCGP組和順鉑組比較，GCGP+順鉑組PAPP-A、uPA蛋白表達降低，IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表達升高(P均<0.05)。見表1。

表1 四組細胞PAPP-A、uPA、IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表達水平比較

3 討論

食管癌的傳統治療方法包括化學治療、放射治療、外科治療、綜合治療等，但均無法降低食管癌術后高復發率及高病死率。新的藥物聯合化療藥物在惡性腫瘤的治療中具有廣闊的應用前景，聯合用藥目前已在急性白血病和胰腺導管腺癌等癌癥的治療中取得一定的療效，其可針對不同致癌細胞信號通路減少單獨用藥的不良反應和并發癥[5]，但其在食管癌中的應用研究尚少。順鉑是傳統的化療藥物，已有研究指出，長期使用該藥物具有一定的耐藥性[6-7]。GCGP由多肽和多糖組成，具有多種免疫調節功能以及抗氧化、清除氧自由基的作用。研究表明，GCGP具有免疫調節、抗腫瘤、抗衰老、調節心血管系統活性、護肝解毒、鎮靜、降血糖等作用[8-10]，作為一種高效抗腫瘤藥物已經引起人們的廣泛關注。

腫瘤的發生發展與腫瘤細胞的過度增殖和凋亡減少密切相關。正常人體組織、細胞的生長受到精確調控，而腫瘤細胞具有無限生長的特性，腫瘤細胞的無限生長是腫瘤細胞凋亡受抑制的結果，細胞凋亡障礙與腫瘤的發生發展具有密切關系[11-13]。本研究結果顯示，與對照組比較，GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組食管鱗狀細胞癌Eca-109細胞集落形成率均降低，細胞凋亡率均升高，且GCGP+順鉑組細胞集落形成率低于GCGP組和順鉑組、細胞凋亡率高于GCGP組和順鉑組。說明GCGP、順鉑單獨或聯合應用均可抑制Eca-109細胞增殖并促進其凋亡，而與單獨用藥相比較，聯合用藥能更加有效地抑制Eca-109細胞增殖、促進細胞凋亡。

MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路是兩條經典的促進生長和抗凋亡的信號轉導通路，當被異?；罨罂纱龠M腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移、血管形成、抑制凋亡、參與自噬等。PAPP-A被認為與促進腫瘤有關，PAPP-A表達與IGFBP-4密切相關，PAPP-A升高可降低IGFBP-4表達，促進腫瘤發生發展[11-12]。IGFBP-4被PAPP-A降解后，IGFBP-4裂解釋放出IGF-1，活化MAPK/ERK信號通路，下游MAPK和ERK被進一步激活[13-15]。uPA是一種高度特異性的絲氨酸蛋白酶，可將纖溶酶原激活成纖溶酶，纖溶酶可降解纖維蛋白、層黏連蛋白，促進腫瘤侵襲和轉移[16]。PI3K普遍存在于靜息細胞的細胞質中，屬于原癌基因的一種，uPA活化可激活PI3K/Akt信號通路，PI3K活化后，下游Akt被進一步激活，該研究結果在乳腺癌細胞中得到證實[17-18]。本研究結果顯示，與正常組相比，GCGP+順鉑組IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表達明顯升高，PAPP-A、uPA蛋白表達明顯下降。這表明下調PAPP-A和uPA蛋白表達，可以激活MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路上的IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表達，從而誘導腫瘤細胞發生凋亡，發揮抗腫瘤作用。

綜上所述，GCGP聯合順鉑能夠抑制食管癌Eca-109細胞增殖，并誘導其發生凋亡，其機制可能與其激活MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路的相關蛋白IGFBP-4、ERK、Akt表達，下調PAPP-A、uPA蛋白表達有關。