茶樹GELP基因家族的鑒定與表達分析

張在寶，王雪珂,王 朔，孫萌柯，陳佳慧，王思雨

(信陽師范學院 生命科學學院/河南省茶樹生物學重點實驗室，河南 信陽 464000)

0 引言

基因不是唯一的，而是屬于多基因家族[1-2]。這些家族產生于基因、染色體片段和全基因組水平的重復[3]。植物基因家族的研究對于開發研究基因組進化的工具和闡明基因功能具有重要意義。植物在受到干旱、寒冷、高鹽、高溫和氧化脅迫等外界各種非生物逆境脅迫時，會進化出一套應對逆境的保護機制以確保植物正常生長發育。在不利的環境下，植物可以通過啟動相關基因表達以及改變某些蛋白結構等來保護體內正常的新陳代謝反應，從而維持植物體結構與功能的完整性[4-5]。在植物逆境信號轉導過程中,Ca2+作為第二信使起著至關重要的作用[6]。脂肪酶是一種水解酶，能催化甘油三酸酯、甘油二酸酯的裂解，釋放出脂肪酸和醇類[7]。GELP酯酶/脂肪酶蛋白是脂質酶的一個非常大的亞科，已在微生物和許多植物中被發現，但只有少數被鑒定為在生長、發育和應激反應中發揮作用。GELP脂肪酶-SGNH水解酶以Seri-Gly-Asn-His為4個保守殘基塊Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，分別有一個靈活的活性部位[8]。因此，GELP酯酶和脂酶具有廣泛的底物特異性，區域特異性和選擇性等多功能特性。

基于水楊酸和病原菌對GELP-脂肪酶基因的誘導，提出了GELP-脂肪酶基因參與植物防御的觀點[9-11]，并證明它們的活性可調節疾病易感性。同樣，GELP-脂肪酶被證明是由各種非生物激發因子誘導的[12-13]，它們能夠提高植物對鹽和其他環境脅迫的耐受性。此外，GELP-脂肪酶被認為參與了與生長過程相關的激素途徑。也有證據表明GELP-脂肪酶的表達與其他發育過程相關[14]。最后，GELP-脂肪酶參與角質層和蠟的代謝也變得越來越明顯，這些物質形成了植物地上部分表皮分泌的角質層[15]。

花粉壁保護花粉粒，并在介導花粉粒與柱頭的早期接觸，從而促進花粉黏附柱頭，促進水合中起關鍵作用?；ǚ郾谟山q氈層細胞合成的富含脂質的化合物組成。GRP17是分離到的第一個花粉壁蛋白，它是花粉落在柱頭后快速水合所必需的蛋白。除了含oleosin結構域的蛋白外，花粉壁蛋白主要由GELP脂肪酶/細胞外脂肪酶(EXLs)組成。擬南芥有6個EXL蛋白(EXL 1～6)，它們在基因組中聚集在一起，都屬于GELPs亞家族。其中EXL4和EXL6富集于花粉壁中。EXL4是擬南芥花粉有效水合的必需基因，該基因功能缺失突變導致花粉水合延遲。EXL6的功能和作用尚不清楚，盡管已知該基因是參與擬南芥花粉發育的關鍵AMS的靶基因[16]。

許多GELP脂肪酶成員在植物中具有重要的功能[17]。從水稻、擬南芥和玉米等植物中分離，測序和鑒定了幾種GELP酯酶/脂肪酶。Enod8是在苜蓿和模型豆科植物中發現的GELP型酯酶/脂肪酶基因，具有乙酰和丁基酯酶活性，但不具有脂肪族酯酶活性[18]。在油菜中，發現一種芥子堿酯酶具有長鏈脂肪族酯類的芥子堿酯酶活性[19]。從向日葵發芽后種子中分離純化了具有脂肪乙?；富钚缘腉ELP酶，從大豆葉片、馬鈴薯中分離純化了幾種具有非特異性乙?；富钚缘腉ELP酶[20]。

本實驗運用生物信息學分析的方法，在茶樹數據庫中進行GELP基因家族檢索，對所得到的茶樹GELP基因家族進行分析，初步探索該基因在茶樹逆境脅迫中的表達特點和響應機制，為其功能驗證和育種工作提供參考。

1 方法

1.1 茶樹GELP基因家族成員鑒定

對擬南芥(Arabidopsisthaliana)數據庫(http: //www.arabidopsis.org/)中的105個GELP基因保守序列蛋白，在茶樹(Camelliasinensis)數據(http://tpia.teaplant.org/index.html)中經同源基因比對獲得茶樹GELP基因組成員信息，為避免重復對獲得的所有序列進行DNAMAN比對篩選。對在茶樹基因庫獲取已知序列的基因號、氨基酸數、等電點、分子量大小等理化性質數據進行分析(https://web.expasy.org/protparam/)。

1.2 茶樹GELP基因家族進化關系

利用MEGA7和Clustalx.exe分析蛋白系統進化關系。

1.3 茶樹GELP基因家族基因結構系列分析

利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進行基因結構分析。

1.4 茶樹GELP基因家族motif分析

利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)進行motif分析。

1.5 茶樹GELP家族啟動子順式作用元件分析

利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行啟動子順式作用元件分析。

1.6 茶樹GELP家族不同處理下的基因表達熱圖分析

在茶樹網站(http://tpia.teaplant.org/index.html)下載4種處理下的基因表達數據，然后通過RStudio軟件對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 茶樹GELP家族蛋白氨基酸理化性質分析

經茶樹數據庫同源比對得到了86條茶樹GELP家族基因，命名為CsGELP1～CsGELP86(表1)。這些基因的片段大小各不相同，編碼的氨基酸在171～753之間，其中CsGELP69編碼氨基酸最小，CsGELP1編碼氨基酸最大。同一亞族不同基因編碼氨基酸數差異不大，如CsGELP7、CsGELP8均屬于家族中的I～d亞族。推測的分子量都為41.977 21 kDa。理論等電點(pI)為5.66。

表1 茶樹GELP理化性質Tab. 1 Physicochemical properties of Camellia sinensis GELP genes

2.2 茶樹與擬南芥GELP家族多序列比對進化分析

在茶樹系統進化樹構建中，茶樹CsGELP基因家族被劃分為4個亞支(圖1)，第Ⅰ和第Ⅱ可進一步細分為6個亞支(Ⅰ中3個，Ⅱ中3個)。

圖1 茶樹(Cs),擬南芥(At)GELP基因進化樹Fig. 1 Camellia sinensis (Cs), Arabidopsis thaliana(At) GELP genes evolutionary tree

考慮到同源基因通常具有相同的功能，為了進一步了解茶樹家族譜系及功能特點，對擬南芥和茶樹GELP家族基因(AtGELP,CsGELP)使用MEGA7軟件，ClustalW比對和Neighbor-joining的方法構建系統發育樹。共有191個基因，其中CsGELP基因有86個、AtGELP基因105個，利用MEGA7中的NJ方法構建了系統發育樹，由圖可知茶樹和擬南芥的GELP基因可分為四個分支(Ⅰ～Ⅳ)(圖1)，第Ⅰ、第Ⅱ和第Ⅳ分支分別由4個、 3個和3個分支組成，第Ⅲ分支由2個分支組成。之前對陸生植物GELP基因的分析顯示有三個主要分支和一個次要分支，這與我們的結果一致。Ⅰa亞族中包含12個擬南芥、2個茶樹基因；Ⅰb里只包含6個擬南芥基因；Ⅰc中包含3個擬南芥基因和5個茶樹基因；Ⅰd中有15個擬南芥基因、11個茶樹基因；Ⅱa中有2個擬南芥基因、6個茶樹基因；Ⅱb中有4個擬南芥基因、1個茶樹基因；Ⅱc中有24個擬南芥基因、18個茶樹基因； Ⅲa有4個擬南芥基因、1個茶樹基因；Ⅲb中8個擬南芥基因、3個茶樹基因；Ⅳa有4個擬南芥基因、4個茶樹基因；Ⅳb有10個擬南芥基因、27個茶樹基因；Ⅳc有14個擬南芥基因、8個茶樹基因。茶樹與擬南芥的GELP基因有較高的同源性，推測直系同源基因之間具有相同的功能。擬南芥的AtGELP39～44屬于Ⅰa和Ⅰb亞族，可能參與授粉與受精，因此推測這兩個亞族中的CsGELP56和CsGELP26也有此功能。

2.3 茶樹GELP家族基因結構分析

從圖2可以看出，CsGELP52整條基因均為外顯子，且CsGELP52在Ⅳb亞族，Ⅳb亞族內CsGELP52不含有內含子，而且這些亞族基因中只有CsGELP52存在內含子缺失現象。該基因家族的外顯子數目都分布在1～13之間。

2.4 茶樹GELP家族motif序列分析

在茶樹GELP家族中共找到了10個motif(圖3)。除CsGELP75 、CsGELP40和CsGELP30外，其他亞族內motif分布的相對比較均勻，尤其在Ⅳc亞族中CsGELP16和CsGELP17；Ⅳb亞族組中CsGELP7和CsGELP8 分布的數量和位置都基本相同，具有高度的保守性，推測在同一亞族內其結構域和功能單位均相似。motif1在所有成員上分布的數量最多，且不同基因的分布情況與其他成員相比差異明顯。

圖2 茶樹GELP基因外顯子-內含子結構分析Fig. 2 Exon intron structure analysis of Camellia sinensis GELP genes

2.5 茶樹GELP家族基因上游2 kb順式作用元件分析

為了確定茶樹GELP基因家族啟動子上游2 kb的順式作用區域，在該基因的起始密碼子上游搜索2 kb堿基序列進行分析(表2)，86條茶樹GELP基因中大部分基因均含有逆境脅迫應答元件MYB和抗寒元件識別位點MYC(圖4)；除CsGELP5、CsGELP7、CsGELP11、CsGELP15、CsGELP16、CsGELP17、CsGELP22、CsGELP24、CsGELP28、CsGELP31、CsGELP33、CsGELP49、CsGELP50、CsGELP52、CsGELP65、CsGELP66、CsGELP73、CsGELP86外，其他基因均含有乙烯應答元件ERE；CsGELP58含有脫落酸元件ABRE最多，推測該基因在ABA脅迫應答機制中起關鍵作用；CsGELP4、CsGELP7、CsGELP9、CsGELP15、CsGELP16、CsGELP17、CsGELP18、CsGELP20、CsGELP21、CsGELP23、CsGELP25、CsGELP27、CsGELP28、CsGELP29、CsGELP31、CsGELP33、CsGELP37、CsGELP38、CsGELP40、CsGELP42、CsGELP44、CsGELP45、CsGELP47、CsGELP48、CsGELP50、CsGELP52、CsGELP53、CsGELP54、CsGELP58、CsGELP59、CsGELP62、CsGELP63、CsGELP66、CsGELP70、CsGELP72、CsGELP75、CsGELP76、CsGELP77、CsGELP80、CsGELP84、CsGELP85這41個基因均含有響應MYB結合位點誘導干旱的作用元件MBS;CsGELP1、CsGELP24、CsGELP52、CsGELP63、CsGELP72、CsGELP79、CsGELP84這7條基因均含有DRE元件，啟動子作用元件決定了該基因對逆境信號的脅迫機制。

圖3 茶樹GELP家族motif1～motif10分析Fig. 3 Camellia sinensis GELP family motif1 ～ motif10 analysis

表2 茶樹GELP上游2 kb順式作用元件分布Tab. 2 Camellia sinensis GELP upstream 2 kb cis element distribution

續表2

續表2

圖4 啟動子氣泡圖Fig. 4 The promoter bubble chart

2.6 茶樹GELP家族基因熱圖分析

在寒冷處理下(圖5)，第7天時CsGELP76、CsGELP25、CsGELP2、CsGELP35、CsGELP36、CsGELP43等基因均上調表達，相對表達量均在對照的1.5倍以上，其中CsGELP25在同組對比處理中均表現下調，推測該基因可能在植物處于寒冷環境脅迫情況下起負調節作用。

在NaCl處理下(圖5)，CsGELP85的表達量顯著上調，是對照的3.6倍，CsGELP44、CsGELP13、CsGELP85、CsGELP1這4個基因表現出不同程度的上調，其余基因都表顯出不同程度的下調，推測這些下調基因在茶樹抗高鹽脅迫中起負調節作用。

在PEG處理下(圖5)，CsGELP44、CsGELP25、CsGELP51均上調表達，相對表達量均在對照的2.6倍以上，其中CsGELP44最高，是對照的12.45倍，推測CsGELP44在植物干旱脅迫中起正向調節作用。

在MeJA處理下(圖5)，CsGELP1、CsGELP55、CsGELP33、CsGELP77、CsGELP71、 CsGELP66、CsGELP76、CsGELP57、CsGELP86、CsGELP15、CsGELP38、CsGELP27、CsGELP85、CsGELP41、CsGELP65、CsGELP68、CsGELP44、CsGELP52、CsGELP26均表現為顯著下調，據此推測這19個基因可能與茶樹抵抗病蟲害有關，并且起負調節作用。而CsGELP39、CsGELP5、CsGELP32、CsGELP48、CsGELP53、CsGELP78、CsGELP63、CsGELP4、CsGELP31、CsGELP74、CsGELP22、CsGELP40、CsGELP56這13個基因起正向調節作用，推測這些基因對茶樹抵抗病蟲害起正調節作用。

CsGELP1、CsGELP12、CsGELP14、CsGELP15、CsGELP18、CsGELP32、CsGELP55這些基因對所有處理相對表達量均表現出下調，推測這些基因可能在植物逆境脅迫中起負調節作用。

3 結論

聚類分析結果表明，茶樹GELP蛋白可分為4個大分支亞族 Ⅰ～Ⅳ，CsGELP36、CsGELP68、CsGELP83 、CsGELP22、CsGELP71與擬南芥GELP同源性較高，說明這些基因在親緣關系方面較為接近。

在茶樹中根據基因結構中內含子分布情況可知：GELP基因家族中存在部分基因中無內含子或者內含子數少于 3 個， CsGELP52基因中不含內含子，因此為內含子缺失類；Ⅳb亞族中的大部分基因以及其他亞族內的基因為內含子富集類。

motif分析結果表明，除Ⅳa亞族的CsGELP75和CsGELP40外，其他亞族內motif分布的相對比較均勻， CsGELP43和CsGELP36、CsGELP16和CsGELP17、CsGELP7和CsGELP8、CsGELP45和CsGELP46分布的數量和位置都基本相同，具有高度的保守性，我們推測在同一亞族內其結構域和功能單位大致相似。

茶樹GELP基因中大部分含有 MYB 轉錄因子和 MYC 應答元件，并且多數基因中含有與 ABA 響應相關的作用元件，說明GELP基因與不同逆境脅迫和植物激素應答機制密切相關，并在其中行使不同的功能。

圖5 不同處理下GELP基因的表達Fig. 5 Under different processing GELP genes expression

現已有研究表明GELP基因在植物逆境脅迫中具有重要的作用。本研究中茶樹GELP基因家族成員在寒冷、NaCl、 PEG、茉莉酮酸激素的誘導下，其表達量均出現不同程度的變化，其中CsGELP1、CsGELP12、CsGELP14、CsGELP15、CsGELP18、CsGELP32、CsGELP55等基因均表達下調，表明這些基因可能在植物抗寒冷、干旱、高鹽和病蟲害途徑中起負調節作用，前期研究表明，Ca2+作為第二信使參與植物多種逆境脅迫的調控機制。本試驗中，PEG 處理下CsGELP44表達量顯著上調，推測CsGELP44參與植物抗干旱脅迫并在其中起關鍵作用，是否為 Ca2+介導信號通路的關鍵基因有待進一步驗證。GELP家族基因在茶樹抗逆境脅迫中起著重要的作用，為后續該基因在功能和作用機制上的研究奠定了基礎以及通過基因手段改良茶樹提供了理論依據。