miR-519d-3p 調控TLR4 抑制脂多糖所致THP-1 源性巨噬細胞炎癥的機制研究

周垂楊 柯樂斌 高仁賢

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是肺部受到急性刺激后引發的嚴重肺部損傷疾病，表現為嚴重的低氧血癥和多器官功能衰竭，在重癥監護病房患者中造成較高的死亡率和不良的預后。盡管機械通氣和對癥治療取得了進步，但針對ALI 患者仍沒有具體有效的治療策略[1]。ALI 過程中肺部的巨噬細胞炎癥反應和上皮細胞的凋亡是導致肺部急性損傷的關鍵因素[2]。巨噬細胞釋放大量炎性因子，誘導局部產生炎癥風暴，同時誘導上皮細胞發生凋亡，探究其中的分子機制將有利于進一步了解和治療ALI[3]。MicroRNA（miRNA）是由20～25 個核苷酸組成的單鏈短非編碼RNA，其主要的功能是通過與靶基因3’UTR 序列結合，誘導mRNA 發生降解，從而抑制基因轉錄后蛋白的翻譯過程。研究表明，miRNA 在調節敗血癥誘導的炎癥，氧化應激和ALI 中發揮著重要的作用[4]。此前研究發現，多種惡性腫瘤miR-519d-3p 表達下調，主要功能為抑制腫瘤細胞增殖、遷移和缺氧應激[5]，而對于炎癥反應研究較少。本研究利用LPS 構建巨噬細胞炎癥模型，探究miR-519d-3p 在ALI 病理損傷過程中對巨噬細胞的活化所引發炎癥的作用及分子機制。

1 實驗材料

1.1細胞株 人髓系白血病單核細胞株（THP-1）購自北京北納創聯生物技術研究院（目錄號BNCC342033）。培養條件：RPMI1640 培養基（含10%熱滅活胎牛血清和1%雙抗）。

1.2試 劑 脂多糖（LPS）（批號46683）、佛波酯（Phorbol ester，PMA）（批號54878）購自美國Sigma公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（批號95465）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）（批號51483）、白介素-6（interleukin6，IL-6）等炎癥因子檢測試劑盒購自美國Sigma 公司。Trizol，熒光定量PCR 試劑購自日本Takara 公司；一步法miRNA 反轉錄試劑盒購自北京信諾金達生物科技有限公司（批號Q1014L）；Lipofectamine 2000 購自Life Technologies（批號11668030）?？贵wp-p65（批號a165648）；T-p65（批 號355648）；p-IκBα（批 號19812）；T-IκBα（批 號498414）；p-RIP3（批 號a29104）；受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1，批號a18498）均購自美國CST 公司；甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號19842）為內參蛋白，購自杭州戴格生物技術有限公司。el-miR-519d-3p 及antago-NC、miR-519d-3p mimic 及mimic-NC，siNC 及siTLR4均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成提供。PCR 引物均由北京擎科生物科技有限公司合成提供。引物序列：miR-519d-3p：F：5′-TGCGGCAAAGTGCCTCCCTTTAG-3′，R：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6：F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

2 實驗方法

2.1THP-1 細胞誘導及LPS 炎癥模型建立 THP-1細胞用含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640 培養基擴增培養，并以3×105個/孔接種于6 孔板中，培養基中添加100ng/mL 佛波酯（PMA，用DMSO 溶解）作用48h，誘導細胞分化為巨噬細胞。每孔中加入200ng/mL LPS 刺激構建炎癥模型，對照組添加磷酸鹽緩沖液（PBS），于處理后12h 后進行后續檢測。

2.2熒光定量PCR（RT-PCR）檢測THP-1 細胞miR-519d-3p 表達 將上述LPS 處理后的細胞利用Trizol 提取總RNA，并利用一步法miRNA 反轉錄試劑盒逆轉為cDNA，后續利用TB Green 進行熒光定量PCR，以U6 為內參，檢測miR-519d-3p 表達水平，以2-△△Ct 法計算相對表達量。

2.3細胞轉染 THP-1 細胞經PMA 誘導48h 貼壁后，按Lipofectamine 2000 說明書轉染antago-miR-519d -3p 及antago -NC、miR -519d -3p mimic 及mimic-NC，轉染方法如下：取2 個1.5mL 離心管分別加入500μL opti-MEN 培養基，兩管中分別加入1μg的質?；?μL Lipofectamine 2000 室溫靜置20min，之后加入到細胞中，轉染6h 后換液。細胞轉染24h后，用LPS 刺激12h，收集細胞上清及細胞進行后續檢測。siTLR4 的轉染同上。

2.4巨噬細胞炎癥水平檢測 采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、IL-6 含量，設置6 個復孔。具體方法按說明書操作。

2.5蛋白免疫印跡測TLR4、p-p65、T-p65、p-IκBα、T-IκBα 蛋白水平 將處理好的細胞用RIPA 裂解液裂解提取全蛋白，進行蛋白免疫印跡（Western blot），經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白后轉膜至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，之后利用5%牛奶封閉，4℃孵育一抗過夜，次日TBS-T 洗去未結合的一抗，加入二抗室溫孵育1h，在PVDF 膜上滴加超敏反應底物進行曝光，利用掃膜儀進行成像分析，檢測Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、磷酸化核因子κB 蛋白（phospho nuclear factor kappa-B，p-NF-κB/p-p65）、總核因子κB 蛋白（total nuclear factor kappa-B，T-NF-κB/T-p65）、磷酸化NF-κB 抑制蛋白（phospho inhibitor of NF-κB，p-IκBα）、總NF-κB 抑制蛋白（total inhibitor of NF-κB，T-IκBα）蛋白水平。

2.6統計學方法 應用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1miR-519d-3p 在LPS 誘導的THP-1 源巨噬細胞表達 與對照組（1.00±0.25）比較，LPS 組（1.85±0.10）細胞內miR-519d-3p 水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3.2過表達miR-519d-3p 拮抗劑可抑制LPS 誘導的巨噬細胞上清液炎癥因子釋放 與antago-NC 組比較，LPS+antago-NC 組細胞上清液TNF-α、IL-6、IL-1β 相對表達量明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），表明LPS 誘導巨噬細胞炎癥模型成功。與LPS+antago-NC 組比較，LPS+antagomiR-519d-3p 組細胞上清液TNF-α、IL-6、IL-1β 相對表達量明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞上清液TNF-α、IL-6、IL-1β相對表達量（）

表1 各組細胞上清液TNF-α、IL-6、IL-1β相對表達量（）

注：TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；IL-1β 為白介素-1β；與antago-NC 組比較，aP＜0.05；與LPS+antago-NC 組比較，bP＜0.05

3.3miR-519d-3p 拮抗劑抑制LPS 誘導的巨噬細胞p-p65、p-IκBα 活化 與antago-NC 組比較，LPS+antago-NC 組p-p65、p-IκBα 蛋白活化水平明顯升高，而T-p65、T-IκBα 無明顯變化。與LPS+antago-NC 組比較，LPS+antago-miR-519d-3p 組細胞中pp65、p-IκBα 蛋白活化水平明顯降低。見圖1。

圖1 各組巨噬細胞p-p65、T-p65、p-IκBα、T-IκBα 蛋白水平

3.4miR-519d-3p 調控TRL4 表達 與antago-NC比較，LPS+antago-NC 組TLR4 蛋白水平明顯升高。與LPS+antago-NC 組比較，LPS+antagomiR-519d-3p組細胞TLR4 蛋白水平明顯降低。見圖2。

圖2 各組巨噬細胞TLR4 表達情況

3.5敲降TRL4 抑制巨噬細胞p-p65、p-IκBα 活化 為了進一步驗證miR-519d-3p 通過TLR4 調控下游p-p65、p-IκBα 活化，我們在巨噬細胞中敲低TLR4，同時過表達miR-519d-3p mimic，經LPS 誘導后，檢測相關蛋白表達。結果顯示，與LPS+siScr+mimic-NC組比較，LPS+siTLR4+mimic-NC 組pp65、p-IκBα 活化水平明顯降低，而LPS+siScr+miR-519d-3p mimic 組p-p65、p-IκBα 活化水平明顯升高。與LPS+siScr+miR-519d-3p mimic 組比較，LPS+siTLR4+miR-519d-3p mimic 組p-p65、p-IκBα 活化水平明顯降低。見圖3。

圖3 各組巨噬細胞TLR4、p-p65、T-p65、p-IκBα、T-IκBα 蛋白水平

4 討論

ALI 中巨噬細胞誘導的急性炎癥反應導致細胞因子和趨化因子的過度釋放以及富含蛋白質的液體的溢出，加劇局部組織損傷破壞。巨噬細胞活化方式分為M1 促炎型和M2 抑炎型，在炎癥過程中，M1 和M2 參與調節固有免疫應答及各種炎癥反應。炎癥早期，巨噬細胞主要極化為M1 型起到清除病原微生物的作用，而隨著炎癥發展，后期則以M2 型為主，發揮抑炎作用，促進損傷修復[6]。LPS 誘導巨噬細胞為M1型是研究炎癥的經典細胞模型，因此，在本研究中，我們利用LPS 刺激的THP-1 源性巨噬細胞炎癥模型，研究miR-519d-3p 在巨噬細胞介導的ALI 炎癥中的作用和機制。

近年研究表明，miRNA 可以用作疾病的生物標志物和治療方法，在癌癥、過敏性疾病[7]、心血管疾病[8]、糖尿病[9]等疾病中均有應用。文獻報道，miR-519d-3p在多種腫瘤細胞表達上調，通過調控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）、Wnt/β-連環蛋白（Wnt/βcatenin）等信號通路的活化，促進腫瘤細胞的惡性增殖、遷移、侵襲[10-13]。此外miR-519d-3p 梗死心肌組織表達上調，通過與HOX 轉錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）相互作用，加劇缺氧誘導的心肌細胞凋亡[14]。研究發現，miRNA 在ALI中起重要作用，miRNA 的表達與免疫應答、炎癥反應等密切相關，且基于其在血液、組織等樣本中表達穩定，miRNA 有望成為ALI 新的生物標志物及潛在的治療靶點。本研究發現，在LPS 誘導的巨噬細胞炎癥模型中，細胞miR-519d-3p 表達明顯上調，提示miR-519d-3p 可能在ALI 中發揮重要作用。

巨噬細胞在LPS 刺激作用下，TLR4 受體表達明顯上調，同時TLR4 信號激活后可最終導致下游NFκB 信號異?；罨?，p-p65、p-IκBα 磷酸化水平增加，促進分泌大量TNF-α、IL-6、IL-1β[15]。本研究發現，巨噬細胞抑制miR-519d-3p 可明顯抑制LPS 誘導的TLR4 受體表達上調，降低的p-p65、p-IκBα 活化水平，減少促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的分泌。表明miR-519d-3p 可能通過抑制TLR4 的表達而降低巨噬細胞內炎癥反應。

綜上所述，本研究結果顯示，miR-519d-3p 在ALI 中低表達，過表達miR-519d-3p 可以抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應，該調控可能通過抑制TLR4 表達水平完成。提示miR-519d-3p 可能作為ALI 診斷治療過程的生物標志物和潛在靶點。