基于網絡藥理學和分子對接技術探討清肺飲治療支氣管哮喘的作用機制

王 瑩 劉麗琴

支氣管哮喘是一種慢性炎癥性氣道疾病，通常由環境過敏原引起，具有復雜的病理機制，臨床表現為喘息、氣促、胸悶、咳嗽。此外，支氣管哮喘也可引起呼吸衰竭、心血管疾病、腎臟疾病、猝死等并發癥[1-2]。支氣管哮喘發病機制包括氣道炎癥、氣道高反應性、可逆性氣道受限、氣道重塑、氣道免疫炎癥和神經調節，多種細胞（如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、肥大細胞、T 淋巴細胞等）及細胞組分參與氣道炎癥的發生[3]。支氣管哮喘歸屬中醫“哮證”“喘證”“上氣”等范疇，中醫認為，哮病的發生是由于宿痰伏肺，遇誘因或感邪引觸，以致痰阻氣道，肺失肅降，痰氣相搏所引起的發作性痰鳴氣喘疾患。清肺飲（又名宣肺止咳合劑）是浙江大學醫學院附屬杭州市胸科醫院院內制劑，由麻黃、葛根、苦杏仁、知母、甘草、僵蠶、石膏七味藥組成，具有止咳平喘、清熱宣肺的功效，對支氣管哮喘有良好的治療作用，臨床療效顯著[4]，但具體的作用機制尚不明確。網絡藥理學是一門新興學科，采用“多成分、多靶點、多途徑”的方法，系統地研究“藥物-靶點-通路-疾病”之間的相互作用，其觀念與中醫藥整體觀、辨證論治的原則一致[5]。本研究采用網絡藥理學方法整體性探究清肺飲治療支氣管哮喘的作用機制，以期為清肺飲的基礎研究提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1清肺飲中化學成分的收集 借助中藥系統藥理數據庫和分析平臺TCMSP（http://tcmspw.com/），檢索得到清肺飲中藥物麻黃、葛根、苦杏仁、知母、甘草、僵蠶、石膏的化學成分。

1.2藥物有效成分篩選 利用TCMSP 數據庫以“口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18、細胞滲透性（Caco-2）＞-0.4”[7]為篩選條件對清肺飲所含化合物進行篩選，并查詢其對應的靶標蛋白。收集化合物靶標蛋白后再通過UniProt 數據庫，限定物種為人，將檢索得到的所有蛋白靶標轉化為規范的靶點蛋白基因標識符（Gene Symbol）。

1.3支氣管哮喘相關疾病靶點的遴選 借助Genecards、OMIM 數據庫搜索關于支氣管哮喘疾病的靶點，以“asthma”為檢索詞進行檢索，收集整合得到與支氣管哮喘疾病相關的靶點。

1.4藥材-化合物-靶點網絡的構建 將清肺飲所含中藥、化合物及交集靶點用Cytoscape 3.7.2 軟件構建中藥-化合物-靶點網絡，對其進行分析，結合在線韋恩圖Venny 2.1，得出不同藥物之間的交集化合物，探討清肺飲的潛在物質基礎。

1.5PPI 網絡構建 將清肺飲與支氣管哮喘交集后的共同靶點導入String 數據庫，并將限定物種為“Homosapiens”設定最低相互作用閥值為“high confidence”0.700 其余參數保持默認設置，進行篩選。結果導入Cytoscape 軟件構建和分析蛋白相互作用網絡，并按“degree”大小進行篩選，構建核心靶點的PPI 網絡圖。

1.6靶點通路分析 為了進一步了解交集基因的功能以及在信號通路中的作用，將篩選得到的交集靶點導入DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），在DAVID 的基因列表通用管理面板中復制粘貼基因列表，Select Identifier 選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”，List Type 設置為“Gene List”，提交基因列表，并限定物種為“Homo sapiens”，進行GO 生物學過程富集分析和KEGG 信號通路富集分析，根據Count 排序取前20，將其結果利用Graphpad Prism 繪制成柱狀圖，使用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）數據庫繪制氣泡圖，進行可視化。

1.7成分-靶點分子對接 利用AutoDock 軟件對清肺飲篩選得到的Degree 前5 位的核心靶點與關鍵成分以及臨床常用治療藥物進行分子對接驗證。具體步驟如下：（1）先從PDB 數據庫（http://www.rcsb.org/）下載核心靶蛋白的結構3D 結構的PDB 格式文件，并運用PyMOL 軟件對蛋白質分子進行去水、去配體等操作，最后使用AutoDock 軟件對靶點蛋白進行加氫及計算電荷處理后，保存為pdbqt 格式文件。（2）在TCMSP 網站下載活性成分的結構文件（MOL2 格式），再用ChemOffice 軟件轉換為3D 結構，并使其結構能量最小，最后使用AutoDock 軟件對3D 結構進行加氫及計算電荷處理后，保存為pdbqt 格式文件。（3）利用AutoDock 對成分與靶點之間的結合活性進行評價，最后運用PyMOL 軟件使對接文件可視化。

2 結果

2.1活性化合物篩選結果 通過TCMSP 數據庫，根據“OB≥30%、DL≥0.18，Caco-2＞-0.4”篩選后，搜索到134 個符合條件的有效化合物，其中麻黃20個，葛根3 個，知母14 個，苦杏仁18 個，甘草88 個，整合后得到128 個化合物。

2.2 清肺飲成分靶點與支氣管哮喘疾病靶點交集結果 清肺飲篩選的成分對應的靶點有121 個，按“1.3”項方法篩選到與支氣管哮喘相關的靶7553 個，二者交集韋恩圖見圖1。

圖1 清肺飲靶點與支氣管哮喘靶點Venn 圖

2.3藥材-化合物-靶點網絡 藥材-化合物-靶點網絡總共包括259 個節點（5 個藥材節點、133 個化合物節點、121 個靶點節點）和1274 條邊，如圖2 所示，綠色箭頭代表藥材，圓形代表化合物，藍色正方形代表靶點基因，玫紅色代表麻黃藥材所含的化合物，紫色代表葛根藥材所含的化合物，橘色代表知母藥材所含的化合物，黃色代表苦杏仁藥材所含的化合物，紅色代表甘草藥材所含的化合物，每條邊表示藥材中所含化合物及化合物與靶點相互作用關系。從圖中可看出清肺飲中存在一個化合物與多個靶點作用，同時也存在不同化合物共同作用于同一個靶點的現象，這體現了中藥多成分與多靶點之間共同作用的機制。在網絡中，一個節點的度值表示網絡中和節點相連的節點的數量，利用節點度值排序確定網絡關鍵節點是目前網絡分析的主要策略之一，根據網絡中的拓撲學性質篩選的中心度值（betweenness centrality）、親中心度值（closeness centrality）、等級值（degree）較大的節點進行分析，一般認為節點的連接度大于等于所有節點連接度2 倍中位數則對整個網絡具有重要的貢獻意義。網絡中度值大于2倍中位數（成分度值中位數＝8，靶點度值中位數＝3）的成分有11 個，靶點有26 個。排名前5 位的化合物分別是MOL000098-槲皮素、MOL000422-山奈酚、MOL000006-木犀草素、MOL000354-異鼠李素、MOL000449-豆甾醇，度值分別是78、35、29、18、18，排名前10位的靶點分別是ESR1、PPARG、AR、NCOA2、PTGS1、PRSS1、GSK3B、ESR2、CHEK1、ACHE，度值分別為87、81、80、70、69、67、63、60、54、31。

圖2 清肺飲藥材-化合物-靶點網絡

2.4清肺飲中交集化合物 由藥材-化合物-靶點網絡可知，清肺飲中不同的藥材里面存在相同的化合物的情況可知，MOL000422-山柰酚為麻黃、知母、甘草所共有；MOL000098-槲皮素為麻黃、甘草所共有；MOL000449-豆甾醇為麻黃、知母、苦杏仁所共有；MOL000358-β-谷甾醇為麻黃、葛根所共有；MOL000492-兒茶素為麻黃、苦杏仁所共有，MOL000392-芒柄花黃素為葛根、甘草所共有，MOL000359 -谷甾醇、MOL002311 -甘草醇、MOL004841-甘草查爾酮B、MOL004908-光甘草定、MOL005017-3，9-二羥基-4-異戊二烯基香豆素為甘草、苦杏仁所共有。

2.5PPI 網絡構建 將上述101 個藥物作用靶點導入STRING 11.0 數據庫，獲得蛋白相互作用數據信息，然后導入Cytoscape 軟件，選取其中度值（degree）大于2 倍中位數的靶點有14 個，這14 個靶蛋白可能是PPI 網絡中的核心靶點，構建14 個核心靶蛋白的PPI 網絡圖（見圖3），網絡中共有14 個節點和66條邊，節點的大小和顏色深淺依據degree 而設定，即節點越大和顏色越深對應的靶基因的degree 越大。

圖3 清肺飲核心靶點PPI 網絡

2.6靶點通路分析 DAVID 中GO 功能富集分析得到GO 條目252 個（FDR＜0.05），其中生物過程（BP）條目116 個，細胞組成（CC）條目44 個，分子功能（MF）條目92 個，分別占46%、17%、37%，排名前20 位的條目見圖4。

圖4 清肺飲作用靶點的GO 富集分析的前20 個通路

KEGG 通路富集篩選得到79 條信號通路（P＜0.05），涉及癌癥通路、乙型肝炎通路、TNF 信號通路、MAPK 通路等，見圖5。

圖5 清肺飲作用靶點KEGG 富集分析的前20 條通路氣泡圖

2.7清肺飲關鍵活性成分-支氣管哮喘靶基因-關鍵通路網絡圖 基于Cytoscape 軟件平臺，選取degree 排名前20 的清肺飲主要活性成分節點、120 個靶基因節點、20 個KEGG 信號通路構建清肺飲關鍵成分-靶基因-信號通路的網絡圖，見圖6。

圖6 成分-核心靶點-信號通路圖

2.8分子對接結果和分析 藥材-化合物-靶點網絡中degree 值排名前5 位的化合物分別是MOL000098 -槲皮素、MOL000422 -山柰酚、MOL000006-木犀草素、MOL000354-異鼠李素、MOL000449-豆甾醇，PPI 中degree 值排名前5 位的核心靶點分別是：MAPK8、ESR1、EGFR、IL6、VEGFA。將PPI中degree 值排名前五位的核心靶點與藥材-化合物-靶點網絡中degree 值排名前5 位的化合物進行分子對接，同時根據《中國支氣管哮喘防治指南》（2016 年版）推薦選擇常用藥β2 受體激動劑沙丁胺醇作為陽性對照藥物，以分子對接結合能來評價配體分子與受體分子的結合程度。一般認為分子對接結合能的絕對值越大，化合物與靶點親和力越強，構象越穩定。絕對值大于4.25 表示具有一定的結合活性，大于5.0 表示具有較好的結合活性，大于7.0表示具有強烈的結合活性，分子對接結果見表1，關鍵藥效成分與核心靶點的最低結合能均大于5.0kcal/mol，且大于陽性對照藥物的結合能，說明這些成分與靶點之間均能夠穩定的結合，選取結合能大于7.0kcal/mol 的對接結果利用Pymol 軟件繪圖，結果見圖7，分子對接結果提示5 個靶點中，MAPK8與豆甾醇的對接評分絕對值最大；靶點MAPK8、ESR1、EGFR、IL6、VEGFA 分別與豆甾醇、異鼠李素、豆甾醇、豆甾醇、豆甾醇的親和力最強，提示豆甾醇可能是清肺飲治療支氣管哮喘的關鍵成分。由圖可見，槲皮素與MAPK8 在VAL-196、VAL-187、THR-178、ARG-150 處形成氫鍵；木犀草素與MAPK8 在LEU-302、TYR-266、ASP-305、CYS-245 處形成氫鍵，與ESR1 在LEU-387、THR-347 處形成氫鍵；異鼠李素與MAPK8 在GLU-109、MET-111 處形成氫鍵，與ESR1 在SER-527、CYS-417、SER-341、MET-343 處形成氫鍵；豆甾醇與MAPK8 在ASN-114、GLN-117 處形成氫鍵，與ESR1 在MET-358 處形成氫鍵，與IL6 在LEU-46 處形成氫鍵，與VEGFA 在GLU-103、TYR-25 處形成氫鍵。

表1 清肺飲活性成分、推薦藥物與支氣管哮喘核心靶點的分子對接結果

圖7 關鍵藥效物質-核心靶點分子對接模式圖

3 討論

3.1核心成分的治療作用分析 本研究運用網絡藥理學構建清肺飲的藥材-化合物-靶點網絡，得到活性成分133 個以及對應靶點121 個。通過分析網絡關系中度值排名前5 的活性成分發現，5 個化合物中有4 個屬于黃酮類成分，豆甾醇屬于植物甾醇類物質。研究證實，槲皮素可通過降低炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10 的表達量而達到抗炎癥的效果[6]。豆甾醇具有顯著抗炎作用，可顯著降低炎癥因子IL-6、IL-1、以及環氧合酶2 mRNA 表達，通過減少PGE2 和NO的釋放發揮其抗炎作用[7]。分子對接結果顯示，關鍵成分與靶點之間均能夠穩定的結合而且結合體構象穩定，表明這些成分可能為清肺飲治療支氣管哮喘的關鍵成分和靶點，其中，豆甾醇與四個關鍵靶點的對接評分絕對值最大，提示豆甾醇可能是清肺飲治療支氣管哮喘的關鍵成分。因TCMSP 數據庫中動物藥和礦物藥成分及靶點信息較少，因此未對處方中的石膏及僵蠶進行成分及靶點的檢索，后期會通過文獻檢索的方式對相關信息進行挖掘，以更全面地了解清肺飲的活性成分及靶點信息。

3.2核心靶點表達與支氣管哮喘的關聯分析 PPI網絡結果顯示，得到的14 個核心靶點主要涉及炎癥、免疫調節、細胞凋亡、信號轉導、癌癥等。其中MAPK8、ESR1、EGFR、IL6、VEGFA 相關度最高，研究發現，MAPK 信號轉導途徑是參與支氣管哮喘發病及進展的一條重要通路，通過調控免疫/炎癥細胞和氣道結構細胞，誘發支氣管哮喘[8]，IL-6 在支氣管哮喘發作期增高，病情緩解后逐漸恢復原水平，參與支氣管哮喘發生、發展的反應過程，可以用來判斷支氣管哮喘的診治情況，評估支氣管哮喘的預后等[9]。EGFR 是通過與其相應的配體結合，促進氣道平滑肌細胞和纖維母細胞的增殖和遷移，參與上皮細胞及組織纖維化的過程，進而使氣道發生重塑，EGFR 的表達量主要在結構性損傷區域增高，且增高程度與支氣管哮喘的嚴重性相關[10]。VEGFA 的大量表達，可以維護肺血管結構、功能的正常及修復損傷等，進而參與支氣管哮喘氣道重塑[11]。

3.3涉及主要信號通路與支氣管哮喘的關聯分析本研究對交集靶點進行了GO 功能富集和KEGG 通路富集，結果發現清肺飲治療支氣管哮喘的生物過程主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、信號轉導、凋亡過程的負調控、DNA 結合轉錄激活、氧化還原過程、蛋白質磷酸化等方面，說明清肺飲的平喘作用可能是一個復雜的多途徑協同作用的結果。KEGG通路分析結果顯示，核心靶點主要富集于TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路等與支氣管哮喘相關的通路，TNF 信號通路是介導炎癥和免疫損傷的重要通路之一，其中TNF-α 是其重要結合位點，通過活化下游NF-κB、Bcl-2 等蛋白激酶可激活NF-κB 信號通路，進而調控炎癥因子的表達[12]。PI3K-Akt 信號通路可以通過多種機制抑制小鼠氣道重塑，PI3K 在支氣管哮喘的發病過程中，能夠調Th細胞的分化及細胞因子的產生，從而影響支氣管哮喘炎癥，發展參與支氣管哮喘的發病[13]。MAPK 在哺乳動物細胞中存在ERK、JNK、p38MAPK 等14 條信號通路，MAPK 信號轉導途徑是參與支氣管哮喘發病及進展的一條重要通路，通過調控免疫/炎癥細胞和氣道結構細胞，引起氣道高反應和氣道重塑，造成Th1/Th2 免疫應答失衡，最終誘發支氣管哮喘[8]。

總之，本研究基于清肺飲在治療支氣管哮喘的臨床有效性，采用網絡藥理學的方法，結合分子對接對其潛在藥效成分、靶標、通路進行了研究，初步明確清肺飲與支氣管哮喘疾病之間的關系，并實現活性分子與靶點蛋白之間關系的可視化，揭示了清肺飲治療支氣管哮喘是多個活性成分通過多條途徑作用于多個靶點蛋白，符合中藥多成分多靶點的特點。但是，目前的工作尚停留在虛擬篩選，只能為研究其作用機制提供參考，后續課題組擬設計動物實驗，對清肺飲治療支氣管哮喘的作用機制進行深入探討，從而更系統科學地闡明其藥理機制，為其臨床應用和新藥研發提供更多參考。