年輕Sca?1骨髓干細胞對年老小鼠心外膜細胞衰老的調控作用及機制研究

董珺 呂饒 高芳 于佳迪 李柳蓁 湛楚藍李月亮 劉慰華 黎佼

1廣州醫科大學附屬第二醫院（廣州 510260）；2山東省濱州市人民醫院（山東濱州 256600）；3廣州醫科大學附屬第六醫院（廣東清遠 511518）

衰老損害了細胞的功能，包括端粒長度縮短、端粒酶活性下降、線粒體活性下降、自噬功能下降等[1-4]。細胞的衰老，同樣影響了細胞移植治療效果[5-8]。心外膜細胞被證實，可以通過促進上皮間質轉化、旁分泌生長因子等途徑，改善心肌梗死后小鼠心臟功能[9-10]。本課題組前期研究證實，年輕Sca?1骨髓干細胞，可通過旁分泌生長因子促進心外膜細胞上皮間質轉化[11]。而衰老對心外膜細胞功能的影響，以及年輕Sca?1骨髓干細胞對年老小鼠心外膜細胞衰老的調控作用鮮見報道。為此，2019年6月至2022年6月，本課題組研究了年輕Sca?1骨髓干細胞對年老小鼠心外膜細胞衰老的調控作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 不同年齡段小鼠選取選取C57BL/6小鼠作為實驗動物（月齡2～3個月作為年輕小鼠，月齡22～23個作為年老小鼠）。購自廣東省醫學實驗動物中心[SCXK（粵）2018?0002]。并通過倫理委員會審查（審查編號：廣醫二院B2021?021）。

1.1.2 主要試劑及儀器細胞分選試劑（Stem Cell Technology，Cat#：18756）；P16免疫熒光染色抗體（Abcam，Cat#：ab54210）；GDNF ELISA檢測試劑盒（Abcam，Cat#：ab171178）；Transwell室（Corning）；熒光定量PCR儀（ABI）。

1.2 方法

1.2.1 Sca?1細胞的提取及鑒定分別收集年輕和年老小鼠股骨中骨髓細胞，通過試劑盒分選Sca?1及Sca?1?細胞，并鑒定細胞比例[10-11]。年輕小鼠來源Sca?1細胞作為年輕組（Y Sca?1），年老小鼠來源Sca?1細胞作為年老組（O Sca?1）。

1.2.2 心外膜細胞培養收集年輕和年老小鼠心臟，0.25%胰酶消化20 min。離心后，收集心外膜細胞于DMEM中。培養1 h后，移除不貼壁細胞。3 d后換液，通過WT1染色鑒定細胞[11-12]。年輕小鼠來源心外膜細胞作為年輕組（Y），年老小鼠來源心外膜細胞作為年老組（O）。

1.2.3 細胞衰老檢測P16免疫熒光染色檢測細胞衰老。細胞（2×105/cm2）經不同處理后，2%多聚甲醛固定細胞，P16一抗（1∶100）4℃染色過夜，二抗室溫染色2 h，熒光顯微鏡下檢測染色陽性細胞。

1.2.4 qRT?PCR檢測收取心外膜細胞總RNA，比較不同處理組中基因表達（P27、Sirt 1、Gdnf）?；蛞镆姳?。

表1 qRT?PCR引物序列Tab.1 The sequences of qRT?PCR primer

1.2.5 Western blot檢測收取心外膜細胞蛋白，比較不同處理組中蛋白表達（P27、Sirt 1）。

1.2.6 細胞共培養Sca?1細胞與年老心外膜細胞（O）通過Transwell小室共培養。無血清，低氧培養（0.1% O2）72 h后，檢測細胞衰老及相關基因與蛋白的表達。

1.2.7 細胞旁分泌生長因子鑒定Y/O組Sca?1細胞，無血清，低氧培養（0.1% O2）72 h后，收集細胞及上清。通過qRT?PCR檢測細胞中Gdnf的表達。通過ELISA檢測試劑盒，檢測細胞及上清中GDNF的表達。

1.3 統計學方法應用SPSS 19.0統計軟件，數據以均數±標準差表示，兩組間采用獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析進行統計學分析。P＜0.05為差異有統計學意義

2 結果

2.1 不同年齡組心外膜細胞的衰老表達對比收集Y及O心外膜細胞（圖1A）。發現在缺氧條件下（0.1%O2），與Y組相比，O組衰老細胞（P16染色陽性）比例上升4倍（圖1B、表2）；衰老相關基因P27表達上升2.26倍（圖1C），抗衰老相關基因Sirt 1下降69%（圖1C、表2）；衰老相關蛋白P27表達上升2.07倍（圖1D），抗衰老相關蛋白Sirt 1下降79%（圖1D、表2，均P＜0.05）。

圖1 心外膜細胞隨年齡增加而衰老表達增加Fig.1 The senescence expression of epicardial cell was increased with ageing

表2 不同年齡組心外膜細胞衰老表達Tab.2 The senescence expression in different age epicardial cell ±s

表2 不同年齡組心外膜細胞衰老表達Tab.2 The senescence expression in different age epicardial cell ±s

項目P16熒光染色陽性細胞比例P27 mRNA Sirt 1 mRNA P27蛋白Sirt 1蛋白Y組17.100±2.451 1.000±0.076 1.000±0.064 1.000±0.102 1.000±0.062 O組68.400±8.577 2.265±0.163 0.331±0.126 2.067±0.603 0.310±0.027 P值＜0.001＜0.001 0.002 0.037＜0.001

2.2 年輕Sca?1骨髓干細胞對年老心外膜細胞衰老表達的調控作用與O Sca?1細胞共培養組相比，Y Sca?1細胞共培養組，衰老細胞（P16染色陽性）比例下降64%（圖2A、表3）；衰老相關基因P27表達下降54%（圖2B），抗衰老相關基因Sirt 1上升2.1倍（圖2B、表3）；衰老相關蛋白P27表達下降57.9%（圖2C），抗衰老相關蛋白Sirt 1上升1.72倍（圖2C、表3，均P＜0.05）。

圖2 年輕Sca?1骨髓干細胞可減少年老心外膜細胞衰老Fig.2 Young Sca1 bone marrow stem cell decreased old epicardial cell senescence

表3 年輕/年老Sca?1骨髓干細胞對年老心外膜細胞衰老的調控作用Tab.3 The effect of young and old Sca?1 bone marrow stem cell on old epicardial cell senescence ±s

表3 年輕/年老Sca?1骨髓干細胞對年老心外膜細胞衰老的調控作用Tab.3 The effect of young and old Sca?1 bone marrow stem cell on old epicardial cell senescence ±s

項目P16熒光染色陽性細胞比例P27 mRNA Sirt 1 mRNA P27蛋白Sirt 1蛋白O+O Sca1組66.400±3.460 1.000±0.061 1.000±0.072 1.000±0.116 1.000±0.107 O+Y Sca1組24.067±1.976 0.465±0.031 2.098±0.310 0.421±0.047 1.720±0.223 P值＜0.001＜0.001 0.003 0.001 0.008

2.3 年齡對Sca?1骨髓干細胞旁分泌生長因子的影響與O Sca?1細胞相比，Y Sca?1細胞中，Gdnf基因表達上升3.01倍，GDNF蛋白的表達上升2.74倍。與O Sca?1細胞上清相比，Y Sca?1細胞上清中GDNF的表達上升2.25倍（圖3、表4，均P＜0.05）。

表4 年齡對Sca?1骨髓干細胞旁分泌生長因子的影響Tab.4 The effect of ageing on Sca1 bone marrow stem cell paracrine function ±s

表4 年齡對Sca?1骨髓干細胞旁分泌生長因子的影響Tab.4 The effect of ageing on Sca1 bone marrow stem cell paracrine function ±s

項目Gdnf mRNA細胞 GDNF（pg/mg）細胞上清GDNF（pg/mg）O Sca1組1.000±0.141 567.857±34.693 118.357±11.840 Y Sca1組3.01±0.723 1 556.399±111.830 266.219±27.902 P值0.010＜0.001 0.001

圖3 年齡對Sca?1骨髓干細胞旁分泌生長因子的影響Fig.3 The effect of ageing on Sca1 bone marrow stem cell paracrine function

2.4 年輕Sca?1骨髓干細胞減少年老心外膜細胞衰老的機制研究中和年輕Sca?1細胞旁分泌的GDNF（R&D，15 μg/mL）。與 Y Sca?1細胞共培養對照組相比，中和GDNF組，衰老細胞（P16染色陽性）比例上升4.79倍（圖4A、表5）；衰老相關基因P27表達上升2.05倍，抗衰老相關基因Sirt 1表達下降62%（圖4B、表5）。衰老相關蛋白P27表達上升1.9倍，抗衰老相關蛋白Sirt 1表達下降52%（圖4C、表5），均P＜0.05。

圖4 年輕Sca?1骨髓干細胞通過旁分泌GDNF減少年老心外膜細胞衰老Fig.4 Young Sca1 bone marrow stem cell decreased old epicardial cell senescence through GDNF

表5 年輕Sca?1骨髓干細胞減少年老心外膜細胞衰老的機制研究Tab.5 The molecular mechanisms study of young Sca1 bone marrow stem cell decreased old epicardial cell senescence x±s

3 討論

近年研究發現，Sca?1干細胞可調控心臟損傷修復[13-16]。在小鼠中敲除 Sca?1 基因，引起小鼠心肌收縮缺陷，并影響心臟祖細胞的增殖能力[17]。相反的，過表達Sca?1，可減少主動脈縮窄引起的小鼠心肌肥大和心臟纖維化，改善小鼠心臟功能[18]。心外膜細胞在心臟發育以及心臟損傷修復中的作用，在近年也得到進一步的關注[19]。有研究發現年齡也影響了Sca?1干細胞的功能。對不同年齡段來源的Sca?1干細胞的對比研究發現，細胞的衰老隨年齡增加而表達增加，例如：端粒酶活性下降[20]。但是年齡對心外膜細胞功能的影響，以及不同年齡段來源的Sca?1干細胞對心外膜細胞的調控作用尚未明確。通過本研究證實隨年齡增加，小鼠心外膜細胞衰老表達增加。年輕Sca?1骨髓干細胞可明顯減少年老小鼠心外膜細胞衰老。

神經膠質細胞源性的神經營養因子（GDNF）在前期研究中，被發現在多種細胞再生中發揮調控作用[21-25]。例如在小鼠唾液腺干細胞的研究中發現，GDNF可促進干細胞存活及增殖，緩解放射損傷[22]。本研究證實與O Sca?1細胞相比，Y Sca?1細胞可分泌更多的GDNF。年輕小鼠Sca?1骨髓干細胞可通過旁分泌GDNF減少年老心外膜細胞衰老。

本研究探討了年輕Sca?1骨髓干細胞對年老小鼠心臟細胞功能的調控作用及分子機制，為衰老相關疾病的細胞治療提供了更多的證據支持。