GRP78在偽狂犬病病毒感染過程中的作用研究

薛曉暖，鄭小惠，辛航闊，謝青青，劉 坤，祁保民，朱 婷

（福建農林大學動物科學學院/蜂學學院福建省畜禽病原感染與免疫學重點實驗室，福建 福州 350002）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科的成員。PRV 可以感染多種哺乳動物，豬是PRV 的唯一天然宿主，病毒通過口腔或者鼻腔感染后進入宿主上呼吸道內復制，然后通過神經末梢侵入外周神經系統，并在其內建立潛伏感染[1-2]。PRV傳染性極強，受感染豬的分泌物和排泄物中存在大量的病毒，主要通過直接接觸傳播，但也可以通過空氣、水和受污染的物品傳播，豬偽狂犬病的暴發難以控制，給養豬業造成嚴重經濟損失[3-4]。

葡萄糖調節蛋白78（Glucose-regulated protein，78 ku，GRP78）是真核生物熱休克蛋白70（HSP70）的家族成員之一，作為一種分子伴侶普遍存在于內質網中以促進蛋白的正確折疊；除此之外，GRP78在調控內質網應激、維持內質網的鈣穩態，抗凋亡以及抗腫瘤的發生和發展過程中發揮至關重要的作用[5]。研究發現，GRP78 除了定位在內質網中，也存在于多種細胞的細胞膜，并且在壓力刺激或者錯誤折疊蛋白積累的刺激下，GRP78可以逃離內質網的束縛而轉移到細胞質和細胞膜，細胞膜上的GRP78被稱為CS-GRP78[6]，CS-GRP78 的顯著增加是許多侵襲性癌癥的特征，如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和結腸癌[7]。此外，CS-GRP78 還可以促進多種病原侵入宿主細胞，相關研究發現，病毒或者細菌的感染可以增加CS-GRP78 的表達，而降低CS-GRP78 的表達可能會阻止病原顆粒的內化，進而阻止其侵入宿主細胞[8]。本研究以GRP78 為研究對象，檢測PRV 感染對GRP78 蛋白的表達和亞細胞定位的影響，通過封閉細胞膜上的GRP78 表位、以及過表達和下調細胞內GRP78 的表達，研究其對PRV 復制的影響，為揭示PRV 的感染和發病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料PK-15 細胞、PRV Min-A 株均由本實驗室保存。DMEM 培養基、胎牛血清、生物素sulfo-NHS-SS-biotin、Lipofectamine RNAiMAX 和兔源PRV 多克隆抗體（pAb）均購自Thermo Fisher 公司；streptavidin 磁珠購自蘇州海貍生物醫學工程有限公司；兔源GRP78 pAb、兔源ATP1A1 pAb購自protein?tech公司；鼠源GRP78單克隆抗體（MAb）購自Santacruz生物技術公司；鼠源β-actin MAb、鼠源GAPDH MAb、HRP標記的山羊抗兔IgG和HRP標記的山羊抗鼠IgG、FITC標記的山羊抗兔IgG 和AF488 標記的山羊抗鼠IgG 均購自北京全式金生物技術有限公司；兔IgG、4%的多聚甲醛溶液、DAPI 染色液和抗熒光淬滅封片液均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 PRV 感染的PK-15 細胞內GRP78 蛋白表達檢測采用MOI 0.1 的PRV 感染PK-15 細胞，分別于37 ℃，5% CO2培養6 h、12 h、24 h 和30 h 時收集細胞，利用RIPA裂解液裂解并分別提取細胞總蛋白，加入2×Loading Buffer煮沸變性后，分別以兔GRP78 pAb（1∶1 000）、兔源ATP1A1 pAb（1∶1 000）為一抗，山羊抗兔IgG-HRP（1∶100 000）為二抗，經western blot 檢測PRV 感染情況和GRP78 蛋白的表達水平。試驗設置添加PBS 的PK-15 細胞為對照組，以β-actin 為內參。

1.3 PRV 感染的PK-15 細胞中GRP78 蛋白的亞細胞定位及其細胞膜蛋白中GRP78 蛋白含量檢測收集1.2 中PRV（MOI 0.1）感染24 h后的PK-15細胞和對照組細胞，分別用4%的多聚甲醛溶液室溫固定細胞30 min，以兔GRP78 pAb（1∶100）為一抗，山羊抗兔IgG-FITC（1∶100）為二抗，DAPI 染色后封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察GRP78 在細胞中的定位情況。

同時，取感染24 h 后的PK-15 細胞和對照組細胞，分別加入1 mg/mL 的sulfo-NHS-SS-biotin，經室溫孵育30 min 后裂解細胞，離心收集上清，向上清中加入streptavidin 磁珠，4 ℃孵育12 h 后離心收集磁珠，向磁珠中加入2×Loading Buffer煮沸后，分別以兔源GRP78 pAb（1∶1 000）、兔源PRV pAb（1∶1 000）、兔源ATP1A1 pAb（1∶1 000）為一抗，以山羊抗兔IgGHRP（1∶100 000）為二抗，通過western blot 檢測細胞膜上GRP78 蛋白的含量，試驗設ATP1A1 作為細胞膜蛋白內參。

1.4 兔源GRP78 pAb 處理PK-15 細胞后PRV 滴度的檢測將不同濃度的兔源GRP78 pAb（50 μg/mL 和100 μg/mL）分別與培養12 h 后的PK-15 細胞孵育1 h 后，對照組細胞則分別使用不同濃度的兔IgG（50 μg/mL 和100 μg/mL）孵育1 h 后，均利用PRV（MOI 0.1）感染24 h 后收集上清， 10 倍倍比稀釋（102～105）后加入PK-15 細胞孵育1 h，加入1%的甲基纖維素，繼續培養3 d 后采用空斑計數測定PRV的病毒滴度[9]。

1.5 GRP78與PRV在PK-15細胞中共定位的間接免疫熒光試驗（IFA）取1.2 中PRV（MOI 0.1）感染24 h后的PK-15 細胞和對照組細胞，分別用4%的多聚甲醛溶液室溫固定細胞30 min，分別不經或者經2%的Triton X-100 透化后，以鼠GRP78 MAb（1∶100）和兔PRV pAb（1∶100）的混合液為一抗，山羊抗鼠IgG-AF488（1∶100）和山羊抗兔IgG-FITC（1∶100）的混合液為二抗，DAPI 染色后封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察GRP78 與PRV 在細胞膜和細胞內的共定位情況。

1.6 下調GRP78 蛋白的表達后PK-15 細胞中PRV復制水平的檢測根據豬源GRP78 基因序列（No.407060），由吉瑪基因股份有限公司設計合成特異性的干擾RNA 分子siGRP78：GGCAGCUGCUAUUG CUUAUTT/AUAAGCAAUAGCAGCUGCCTT，以 及1 條無關干擾分子siNC：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT/ACGUGACACGUUCGGAGAATT， 采 用Lipofectamine RNAiMAX 轉染試劑分別將siGRP78 和siNC 轉染PK-15 細胞，37 ℃，5% CO2培養48 h 后感染MOI 0.1 的PRV，繼續培養24 h 后分別收集細胞沉淀和上清，細胞沉淀采用RIPA 裂解液裂解后，加入2×Loading Buffer 煮沸，分別以兔源GRP78 pAb（1∶1 000）、兔源PRV pAb（1∶1 000）為一抗，羊抗兔HRP-IgG 為二抗，通過western blot 檢測GRP78 蛋白的表達水平和PRV 的增殖水平，實驗以β-actin 為內參。另外將收集的上清液分別10倍倍比稀釋（102～105）后加入PK-15細胞孵育1 h，加入1%的甲基纖維素，繼續培養3 d后采用空斑計數試驗測定PRV的病毒滴度[9]。

1.7 過表達GRP78 蛋白的表達后PK-15 細胞中PRV 復制水平的檢測使用Lipofectamine 2000 將本實驗室前期制備的重組質粒pCMV-GRP78 和空載體質粒pCMV-FLAG 分別轉染PK-15 細胞，37 ℃、5%CO2培養48 h后，采用MOI 0.1 PRV感染細胞，繼續培養24 h后分別收集細胞沉淀和上清，參照1.6中western blot 方法檢測GRP78 蛋白的表達水平和PRV 的增殖水平，通過空斑計數試驗測定PRV 的病毒滴度[9]。

2 結 果

2.1 PRV 感染對GRP78 蛋白表達影響的檢測結果分別收集PRV（MOI 0.1）感染6 h、12 h、24 h 和30 h的PK-15細胞，通過western blot 檢測PRV感染情況及GRP78 蛋白表達的變化，結果顯示，PRV 感染12 h 后可檢測到PRV蛋白的表達，表明PRV已侵入PK-15細胞并增殖；另外，與對照組相比，PRV 感染PK-15細胞后各時間點GRP78 蛋白的表達水平均無顯著變化（圖1）。表明PRV 感染不影響GRP78 蛋白的表達。

圖1 PRV感染對GRP78蛋白表達影響的檢測結果Fig.1 Effect of PRV infection on GRP78 protein expression

2.2 PRV 感染的PK-15 細胞內GRP78 亞細胞定位及其細胞膜上GRP78 蛋白含量的檢測結果研究表明，在壓力刺激、病原微生物感染或者錯誤折疊蛋白積累的刺激下，細胞內的GRP78 可以轉移到細胞膜上，從而發揮重要作用[10]。本研究通過激光共聚焦顯微鏡觀察PRV 感染24 h 后PK-15 細胞中GRP78的定位，結果顯示， PRV 感染PK-15 細胞后細胞膜出現明顯的綠色熒光，且熒光強度明顯強于PBS 對照組（圖2A）。進一步通過生物素標記細胞膜上所有的蛋白，然后用可以與生物素相結合的streptavidin磁珠分離細胞膜蛋白，再用GRP78 的特異性抗體檢測細胞膜上的GRP78 蛋白，結果顯示，與PBS 對照組相比，PRV 感染細胞的細胞膜上的GRP78 蛋白水平顯著增加（P＜0.05，圖2B，圖2C）。以上結果表明PRV 感染可以增加細胞膜上GRP78 的蛋白含量。

圖2 PRV感染對GRP78在細胞膜分布影響的檢測結果Fig.2 Effect of PRV infection on the distribution of GRP78 in cell membrane

2.3 GRP78 pAb 處理PK-15 細胞后對PRV 復制影響的檢測結果PK-15 細胞分別與50 μg 和100 μg 的兔源GRP78 pAb 共孵育后感染PRV，通過空斑試驗檢測細胞培養上清中PRV 滴度，結果顯示，與兔IgG 對照組相比，50 μg 和100 μg 的GRP78 pAb 孵育細胞后再感染PRV 組的病毒滴度均未見明顯降低（圖3）。表明GRP78 并不是PRV 侵入宿主細胞的關鍵因子，但可能參與PRV 從PK-15 細胞內的釋放。

圖3 GRP78 pAb處理PK-15細胞后對PRV復制影響的檢測結果Fig.3 Influence of anti-GRP78 antibody on the of PRV in PK-15 cells

2.4 GRP78 與PRV 在PK-15 細胞中共定位的檢測結果PRV 感染PK-15 細胞24 h 后，通過IFA 分別檢測GRP78 與PRV 在細胞膜和細胞內的共定位情況，結果顯示，未經Triton X-100 透化的細胞經相應IFA檢測后，細胞膜表面GRP78 蛋白的紅色熒光與PRV蛋白的綠色熒光無共定位（圖4A）；經Triton X-100透化的細胞經相應IFA 檢測，結果顯示，細胞內GRP78 蛋白的紅色熒光與PRV 蛋白的綠色熒光有明顯的共定位現象（圖4B）。表明GRP78 與PRV 在細胞膜無共定位，但是二者在細胞質中有共定位。

圖4 GRP78與PRV在PK-15細胞中共定位的檢測結果Fig.4 Detection of GRP78 and PRV co-localization in PK-15 cells

2.5 下調GRP78 蛋白的表達對PRV 復制影響的檢測利用western blot檢測siGRP78干擾后的PK-15細胞，結果顯示，與siNC 對照組相比，siGRP78 干擾組GRP78 蛋白的表達水平顯著降低（圖5A、圖5C），且siGRP78 干擾組的PRV 蛋白水平顯著低于siNC 對照組（P＜0.05，圖5B、圖5D）。將收集的細胞上清進行空斑試驗以檢測PRV的病毒滴度，結果顯示，與siNC對照組相比，siGRP78 干擾組PRV 的病毒滴度顯著降低（P＜0.05，圖5E）。以上結果表明，下調GRP78 蛋白的表達可顯著降低PRV 的釋放。

圖5 敲低GRP78的表達對PRV復制影響的檢測結果Fig.5 Effect of knockdown GRP78 expression on PRV replication

2.6 過表達GRP78 蛋白的表達對PRV 復制影響的檢測利用western blot檢測過表達GRP78對PRV復制的影響，結果顯示，與轉染空載體pCMV-FLAG相比，轉染pCMV-GRP78質粒的細胞中GRP78蛋白的表過水平顯著增加（P＜0.05，圖6A、圖6C），而轉染pCMVGRP78 質粒的細胞與空載體pCMV-FLAG 轉染組相比，PRV蛋白水平未見明顯差異（圖6B、圖6D）。將收集的細胞培養液進行空斑試驗，以檢測PRV 的病毒滴度，結果顯示，轉染pCMV-GRP78質粒的細胞培養液中的病毒滴度顯著高于空載體pCMV-FLAG 轉染組（P＜0.05，圖6E）。以上結果表明，過表達GRP78 蛋白可以顯著增加細胞培養液中PRV 的滴度。

圖6 過表達GRP78對PRV復制影響的檢測結果Fig.6 Effect of overexpression of GRP78 on PRV replication

3 討 論

GRP78 是熱休克蛋白家族HSPA5 的成員，主要存在于真核細胞的內質網膜上，負責調控非折疊蛋白反應，以促進蛋白的正確折疊或者促進錯誤折疊蛋白通過內質網相關蛋白降解（ERAD）途徑被清除[11]。在應激條件下，GRP78 在細胞膜上大量表達，與細胞表面的大量配體或者其他蛋白結合，在信號傳導、細胞增殖和遷移、細胞凋亡、炎癥反應等方面發揮重要作用。同時，細胞表面的GRP78 也成為多種病原（細菌、真菌和病毒）進入細胞的工具[10,12]。本研究發現，PRV 感染PK-15 細胞并不影響GRP78 蛋白的表達，但可以增加細胞膜上GRP78 蛋白的含量，提示GRP78向細胞膜的轉移可能與病毒的侵入、復制或者釋放有關。研究發現，GRP78廣泛分布在N2a 細胞、小鼠原代神經元細胞和人上皮細胞Hun-7 的細胞膜上，并且可以與乙型腦炎病毒（JEV）的囊膜蛋白結構域Ⅲ結合參與病毒的感染[5]。中東呼吸綜合征病毒（MERS-CoV）感染可以增加細胞膜上的GRP78 蛋白水平，這有助于病毒的侵入、吸附和復制[13]；在鴨坦布蘇病毒（TMUV）感染過程中，GRP78作為細胞的受體介導病毒感染，利用抗體阻斷細胞膜上的GRP78 蛋白表位可以顯著地阻止TMUV 的感染[14]。GRP78還作為登革熱病毒2 型（DFV-2）的受體，使用抗體封閉細胞表面的GRP78 蛋白表位，可以阻止該病毒的感染[15]。但本研究進一步采用兔多克隆抗體封閉PK-15 細胞表面的GRP78 蛋白表位，檢測其對PRV 復制的影響，結果顯示，封閉細胞表面的GRP78 蛋白表位并未影響PRV 的感染，表明GRP78并不是PRV 侵入宿主細胞過程中的關鍵因子。

除了介導病毒侵入，GRP78 在病毒蛋白的合成、成熟和釋放過程中也發揮重要的作用。在病毒復制過程中，GRP78 的缺失可能導致病毒蛋白合成減少或病毒蛋白的錯誤折疊，導致出芽或未成熟的病毒粒子受損，傳染性減弱。其次，GRP78 還可以通過維持內質網穩態促進病毒各組分的組裝，為病毒的成熟提供有利的環境[16]。寨卡病毒（ZIKV）感染可以增加GRP78 蛋白的表達，并且ZIKV 囊膜E 蛋白可以與GRP78 結合，缺失GRP78 的表達能夠明顯降低病毒蛋白的翻譯和病毒粒子的釋放[17]。GRP78 對人巨細胞病毒（HCMV）的組裝和釋放也是必需的，抑制GRP78 的功能能夠顯著降低感染性病毒粒子的釋放，導致病毒核衣殼滯留在細胞核或核膜外[18]。此外，GRP78 還可與病毒顆粒結合，從而增強病毒的感染性，研究發現，GRP78 存在于日本腦炎病毒（JEV）的病毒顆粒中，而缺乏GRP78 的成熟病毒顆粒的感染性顯著降低[19]。而本研究發現，GRP78 與PRV 在細胞膜無共定位，但是二者在細胞質內有共定位現象；此外，本研究利用RNA 干擾技術下調PK-15 細胞內GRP78 蛋白的表達能夠顯著降低細胞內PRV 蛋白的合成和細胞上清中的病毒滴度，但PK-15 細胞內過表達GRP78 雖然能夠增加細胞培養液上清中的病毒滴度，但并不影響細胞內PRV 蛋白的合成。GRP78 是一種重要的內質網分子伴侶，參與維持內質網的穩態和蛋白翻譯[11]，因此推測上述結果可能是由于細胞內現有的GRP78 足以維持病毒蛋白的合成。 此外，過表達和下調GRP78 的表達均能夠影響細胞培養液中的病毒滴度，提示GRP78 可能參與病毒向細胞外的釋放或者介導感染性病毒粒子在細胞間的傳播。 研究表明，在HCMV 和JEV 感染過程中，阻止GRP78 的表達并不影響細胞內病毒蛋白的合成，但能顯著降低感染細胞培養液中病毒滴度[18-19]。這和本研究結果一致。此外，近期研究發現GRP78 與乙肝病毒（HBV）衣殼蛋白preS1 相互作用，正向調節病毒粒子的釋放[20]。因此，結合上述研究報道和本研究結果推測，GRP78 是PRV 感染細胞的重要宿主因子，參與PRV從宿主細胞中釋放到胞外，但是否影響病毒的包裝、病毒粒子的成熟等過程，這些具體的分子機制還需要后續進一步的研究。

本研究初步探究了GRP78在PRV感染過程中的作用，證實GRP78作為一種重要的宿主因子正調控PRV的釋放，為進一步研究PRV的感染機制奠定了研究基礎。