外周血miR-21、miR-15a表達對原發性肝癌患者淋巴結轉移的診斷分析

梅建民， 聶洪峰， 孫伯洋， 姚軍波

中國人民解放軍總醫院第七醫學中心肝膽外科，北京 100700

原發性肝癌(primary liver cancer，PLC)是目前最為常見的惡性腫瘤類型之一，在我國其發病率和死亡率均位居第2[1]。目前國內外仍缺乏高效的PLC治療方案，患者的5年生存率僅有10%～15%[2]，而如何增強患者的療效、提高其生存率仍是該領域目前研究的重點。研究[3]認為，淋巴結轉移是PLC患者復發/轉移、死亡的危險因素，需及時清除轉移的淋巴結。術前影像學檢查可反映淋巴結轉移的發生情況，但準確性不甚理想，容易漏診，且淋巴結腫大和淋巴結轉移鑒別難度大。miR-21、miR-15a均在既往的研究中被證實與惡性腫瘤有密切關系[4-6]，其中miR-21有調控細胞增殖、凋亡、遷移等作用，且在PLC患者中其表達升高，可抑制磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phospatase and tensing homolog, PTEN)基因發揮促癌作用[7]；miR-15a不僅可調控細胞增殖、生長和凋亡，還可影響其遷移與侵襲活性，且有研究指出在早期乙型肝炎病毒感染患者中血清miR-15a表達下降[8]。但PLC患者外周血miR-15a表達變化及miR-21、miR-15a是否可評估淋巴結轉移情況尚需進一步探討。本研究回顧性分析96例PLC患者和88名健康志愿者的資料探討上述問題，以期尋找可靠的淋巴結轉移評估指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析我院2018年3月至2020年4月收治的96例PLC患者和招募的88名健康志愿者的資料，分別記為A組和B組。A組男78例，女18例，年齡(56.55±7.81)歲(37～65歲)，臨床分期：Ⅰb期2例、Ⅱa期17例、Ⅱb期36例、Ⅲa期41例，肝功能Child分級：A級37例、B級59例，組織分型：肝細胞癌78例、膽管上皮癌14例、混合性肝癌4例。根據配對原則選取B組，B組男73名，女15名，年齡(57.05±7.65)歲(35～65歲)。兩組性別、年齡相比，差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究符合世界醫學大會赫爾辛基宣言。本研究經過我院倫理委員會批準。

1.2 納入及排除標準納入標準：(1)A組均經病理證實為PLC，B組均為健康志愿者；(2)成年人，且年齡均≤65歲；(3)A組均符合根治性切除術指征，且均實施該術式；(4)A組均經病理檢查明確淋巴結轉移情況。

排除標準：(1)復發性肝癌或轉移性肝癌者；(2)有精神或溝通障礙者；(3)外周血miR-21、miR-15a檢測與淋巴結轉移病理檢查間隔時間≥1個月者；(4)資料記錄不完整者。

1.3 方法血清miR-21、miR-15a檢測方法：A組均于確診后治療前、B組均于納入研究后空腹檢測外周血miR-21、miR-15a表達，空腹抽取5 ml靜脈血，室溫靜置1 h，離心分離(1 500 r/min，10 cm，10 min)，取上清液按照血清總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司，貨號15596018)操作，鑒定其純度。采用miScript試劑盒(德國QIAGEN公司，貨號218160)利用ploy(A)聚合酶加尾逆轉錄獲得互補的脫氧核糖核酸(cDNA)，設置反應體系：0.5 μg總RNA+4 μl逆轉錄混合反應液+1 μl反轉錄酶混合液。采用聚合酶鏈反應試劑盒(美國Sigma公司，貨號MP0035-1KT)進行處理，設置U6為內參，其中miR-21 RT引物序列：5′-ATCGCTAAGAGCTATATGCTAGAGC-3′，qRT-PCR引物正義鏈：5′-TCGTAGAGCTAGAGCTAGC-3′，qRT-PCR引物反義鏈：5′-AGCTAGAGGCTAGAGCTA-3′；miR-15a RT引物序列：5′-GTTGGCTTAGAGCTAGAGCTAGACTAGCTA-3′，qRT-PCR引物正義鏈：5′-CTGATAGCTATAGCTAG-3′，qRT-PCR引物反義鏈：5′-ATGTGGGGATAGCTAGCTAG-3′，U6 RT引物序列：5′-TGCGATAGGCTATAGCGGAGAGATCGAGACTAG-3′，qRT-PCR引物正義鏈：5′-TGGGATAGCGGATAGCTAGCTA-3′，qRT-PCR引物反義鏈：5′-AGCGCGATAGGCGGCTAAGCTA-3′。PCR儀(美國ABI公司，9700型)反應流程：95 ℃ 3 min(預變性)，90 ℃ 5 s(變性)，60 ℃ 30 s(退火)，54 ℃ 60 s(延伸)，共40個循環，最后72 ℃ 10 min終止反應。當溫度由60 ℃升至95 ℃，利用PCR儀定時監測熒光信號，繪制溶解曲線，計算2-△△Ct值，其中△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內參)，△△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內參)-[Ct(基準樣品)-Ct(內參)]。

1.4 觀察指標(1)對比A組、B組血清miR-21、miR-15a表達；(2)對比A組中有和無淋巴結轉移患者血清miR-21、miR-15a表達，其中淋巴結是否轉移以病理檢查結果為“金標準”；(3)分析血清miR-21、miR-15a及二者聯合對A組淋巴結轉移的評估價值，其中二者評估均為陽性即認為聯合評估陽性，二者評估任一項為陰性即認為聯合評估陰性。

2 結果

2.1 A組、B組血清miR-21、miR-15a表達對比A組血清miR-21表達高于B組，miR-15a表達低于B組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 A組、B組血清miR-21、miR-15a表達對比

2.2 A組中有和無淋巴結轉移患者血清miR-21、miR-15a表達對比A組中有29例患者有淋巴結轉移，淋巴結轉移發生率為30.21%(29/96)。29例淋巴結轉移患者均經術中所見(未實施手術者均經肝穿活檢后病理檢查)證實，其中門腔間隙組、肝門組、腹主動脈旁組、腹腔肝動脈旁組、腸系膜上動脈旁組、肝胃韌帶組、膈腳后組、肝十二指腸韌帶組、心包旁組分別有15例、8例、7例、4例、3例、2例、1例、1例、1例，占比分別為51.72%、27.59%、24.14%、13.79%、10.34%、6.90%、3.45%、3.45%、3.45%，2組同時轉移者5例，3組及以上同時轉移者3例，占比分別為17.24%、10.34%。

A組中有淋巴結轉移患者與無淋巴結轉移患者的性別、年齡、組織分型比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，有淋巴結轉移患者肝功能Child分級B級占比高于無淋巴結轉移患者(P<0.001，見表2)。

表2 A組中有和無淋巴結轉移患者一般資料比較

A組中有淋巴結轉移患者血清miR-21表達高于無淋巴結轉移患者，miR-15a表達低于無淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

表3 A組中有和無淋巴結轉移患者血清miR-21、miR-15a表達對比

2.3 血清miR-21、miR-15a及二者聯合對A組淋巴結轉移的評估價值分析血清miR-21、miR-15a對A組淋巴結轉移評估的Cut-off值分別為1.43、0.28，二者聯合評估的靈敏度、特異度、AUC分別為96.55%、97.01%、0.938，其中靈敏度與單獨評估相當，特異度、AUC均高于單獨評估，且AUC對比差異均有統計學意義(Z=3.728，P=0.021；Z=2.115，P=0.039)(見圖1、表4)。

表4 血清miR-21、miR-15a及二者聯合對A組淋巴結轉移的評估價值分析

圖1 血清miR-21、miR-15a及二者聯合對A組淋巴結轉移的評估價值

3 討論

淋巴結轉移是指浸潤的腫瘤細胞穿過淋巴管壁脫落并隨著淋巴液至匯流區，并以此為中心形成新病灶的病理現象，淋巴結轉移可廣泛累及臟器組織，也是腫瘤最為常見的轉移方式之一[9-10]。報道[11]顯示，PLC患者若有淋巴結轉移需及時清除，方可延緩病情發展，一旦伴有廣泛淋巴結轉移甚至是骨轉移，將會增加治療難度，且此類患者大多生存期僅為3～6個月。因此，及早發現轉移的淋巴結并及時清掃對控制PLC患者的病情發展有至關重要的作用。然而目前臨床上常用的淋巴結轉移診斷方法仍有局限性，血清腫瘤標志物表達評價淋巴結轉移情況常不具有特異性[12]，亟待探討新的、敏感度和特異度高的評價指標。

miRNAs是一類短序列、非編碼的小分子RNA，通常情況下包含有20～22個核苷酸，具有生物學調控功能。miRNAs可與靶mRNAs的3端非編碼區互補結合，導致后者翻譯抑制。研究[13-14]發現，miR-21均是細胞內重要的核酸調節分子，可控制細胞內信息流量，參與細胞增殖、生長、遷移、凋亡等過程，并且還可參與調控生物生長發育。本研究中A組血清miR-21表達高于B組，可知在PLC患者中血清miR-21偏高。有報道[15]顯示，PLC患者中血清miR-21表達升高，本研究結果與上述報道相符。另有研究[16]顯示，在膽管癌發生過程中，miR-21表達無明顯變化，本研究報道與該研究不一致，分析可能由于在不同部位惡性腫瘤發生和發展過程中miR-21的作用與機制不同所致。miR-21可調控多種抑癌基因，如PTEN、組織金屬蛋白酶抑制劑3、Kazal基序逆向誘導富含半胱氨酸蛋白等，使得上述抑癌基因表達下降，惡性腫瘤細胞的增殖、遷移能力均增強，而凋亡受抑制，因此可參與肝癌的發生和發展。本研究還發現，A組患者淋巴結轉移發生率為30.21%，提示探討理想的淋巴結轉移評估指標有其重要性和必要性。本研究中有無淋巴結轉移患者的性別、年齡、組織分型均接近，表明二者具有可比性；有淋巴結轉移患者肝功能Child B級占比高于無淋巴結轉移患者，可能是因為有淋巴結轉移患者病情更嚴重，肝功能受損也越嚴重。本研究中ROC分析發現，血清miR-21對A組淋巴結轉移評估的Cut-off值為1.43，靈敏度為100%，特異度和AUC分別為76.12%、0.836，表明血清miR-21可用于評估PLC患者淋巴結轉移情況。既往研究[17]顯示，PLC患者有淋巴結轉移者血清miR-21高于無淋巴結轉移者，本研究結果與該研究一致，且上述報道還顯示血清miR-21高表達與淋巴結轉移相關。分析其中原因為：miR-21表達越高，對各種抑癌基因的抑制作用越強，惡性腫瘤細胞遷移的活性越強，因此更容易發生淋巴結轉移，且血清miR-21可作為淋巴結轉移的評價指標。

本研究還發現A組血清miR-15a表達低于B組，且A組中有淋巴結轉移者血清miR-15a表達低于無淋巴結轉移者，表明PLC患者血清miR-15a表達偏低，且有淋巴結轉移者其表達更低。有研究[18-19]發現，miR-15a表達下降可激活可易位C-myc基因和蛋白的表達，增加細胞周期蛋白D1的活性，從而導致細胞無限增殖，參與組織損傷，誘發惡性腫瘤。本研究結果與上述報道中的部分結果相符，共同表明血清miR-15a表達下降可能是PLC發生和發展的重要因素。根據上述分析可以推測，血清miR-15a表達越低，C-myc和細胞周期蛋白D1的活性越強，細胞的惡性程度越高，淋巴結轉移的風險也可能會隨之增加。本研究ROC分析結果中顯示，血清miR-15a表達評估A組淋巴結轉移的Cut-off值為0.28，且靈敏度、特異度、AUC分別為96.55%、85.07%、0.884，說明血清miR-15a表達可用于評估PLC患者淋巴結轉移情況。

血清miR-21可通過調控多種抑癌基因參與PLC的發生和發展，而miR-15a則可通過調控C-myc和細胞周期蛋白D1促進PLC的發生和發展，因而了解二者的表達變化可從不同角度了解此類患者的病情狀況。本研究中血清miR-21聯合血清miR-15a評估A組淋巴結轉移的靈敏度與單獨評估相當，特異度和AUC均高于單獨評估，提示二者聯合對PLC患者淋巴結轉移情況的評估效能更高。

綜上所述，在PLC患者中血清miR-21表達偏高，而miR-15a表達偏低，且有淋巴結轉移者前者的表達更高，后者的表達更低，二者聯合評估淋巴結轉移的靈敏度與單獨評估一致，特異度和AUC均較高，建議聯合二者進行評估以提高效能。