HLA-DQBI基因多態性與兒童哮喘易感性及糖皮質激素療效關系研究

鄭曉宇，魏兵，廖世峨，張超，劉亞軍，朱麗

(1.錦州醫科大學北部戰區總醫院研究生培養基地；2.北部戰區總醫院新生兒科，遼寧 沈陽 110016)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種以慢性氣道炎癥為特征的有一定潛在危險的異質性疾病，具有可變性呼氣氣流受限[1-2]。疾病花銷、入院率及死亡率正逐年攀升。兒童哮喘發病與環境、基因及環境與基因間的相互作用有關[3]。

主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)的基因密集區位于染色體6p21.23，研究表明該處基因可能與哮喘相關表型有關[4],MHC區域的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點主要位于人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)I類和II類分子上[5]，有助于免疫系統發揮對抗外來入侵的作用。有研究表明[5]123-134HLA-DQ等位基因與哮喘表型間存在關系，DQ異構蛋白在哮喘發病中有重要作用。HLA-DQ與其他基因在兒童肺炎支原體感染相關哮喘中也存在交互作用[6]。HLA-DQB1的多個SNP位點也被證實可能與巴基斯坦旁遮普地區人群哮喘發作有關[7]。

HLA-DQB1 rs1063355位點曾被報道可能與亞洲裔印度人哮喘易感性相關[8]，全基因組關聯研究(genome-wide association studies,GWAS)提示HLA-DQB1基因位點多態性可能與哮喘相關，尚無兩個SNP位點多態性與東北地區漢族兒童哮喘易感性間研究。因此，本研究擬通過分析中國東北地區哮喘患兒HLA-DQB1 rs1063355、rs6906021位點SNPs及臨床資料，研究其與兒童哮喘發病及吸入糖皮質激素(inhaled corticosteroids,ICS)療效間關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

將2016年10月至2020年10月在北部戰區總醫院診斷哮喘的來自東北地區6～12歲106例漢族兒童納入病例組，符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[9]診斷標準，排除其中患有先天免疫缺陷病和胃食管反流等會引起兒童反復喘息的其他種類疾??；且入組前未使用過任何抗哮喘治療藥物。其中男57 例，女49 例，平均年齡(8.2±2.0)歲。選取同期就診的100例來自東北地區漢族健康兒童作為對照組，對照組中男55例，女45例，平均年齡(8.9±2.2)歲，經對比兩組在年齡、性別上均無明顯差異(t=-2.778，χ2=0.031，P>0.05)，具有可比性。倫理批準號：Y(2020)054號，家屬知情同意。對所有病例組兒童根據哮喘嚴重分級方法及急性發作期臨床特征分組。病例組給予吸入用糖皮質激素布地奈德混懸液霧化吸入、每次1 mg、每日2次，逐步減量，并于入組時及入組3個月分別行肺功能檢測及C-ACT/ACT量表評估。排除其中因為不良反應(n=2)、失訪(n=11)、數據不完整(n=14)等因素的研究對象，共79例符合療效研究條件。

1.2 基因檢測

1.2.1 DNA提?。翰杉庵苎? mL，置于EDTA抗凝管，經臺式離心機Mikro120進行30 min離心處理后留取下層血細胞，試劑盒進行DNA提取，采用HF8/HF16 核酸純化儀。

1.2.2 引物設計及合成：依次對DNA樣本進行電泳、質量檢查及濃度評估及稀釋。查找GeneBank上發表的關于人HLA-DQBI rs1063355、rs6906021基因部分序列，采用PREMERPLEX2設計引物，由上海生工生物進行引物合成及純化，設計引物見表1。反應體系共20 μL，組成包含1 × 10X buffer(Takara.)，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μL 樣本DNA和1 μL多重PCR引物。在10 μL PCR產物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，在37 ℃條件下溫浴1 h，然后在75 ℃條件下滅活15 min。經過PCR及SNaPshot多重單堿基延伸反應后，向延伸產物中加入1 U SAP酶，在37 ℃條件下溫浴1 h，然后經過75 ℃滅活15 min，取0.5 μL延伸產物，與0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di 混勻，95 ℃變性5 min。

表1 引物設計

1.2.3 測序

ABI3730XL對產物測序，用 GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA)分析原始數據。rs1063355位點熒光吸收峰圖如圖1所示，rs6906021位點熒光吸收峰圖，見圖2。

黑色箭頭所指即為等位基因位置，從上至下依次為T/T型、T/G型、G/G型

黑色箭頭所指即為等位基因位置，從上至下依次為T/T型、T/C型、C/C型

1.2.4 肺常規通氣功能測定及C-ACT/ACT評分

德國Jaeger公司Master Screen測試系統在入組時及入組3個月后分別檢測肺功能，共檢測3次；記錄患兒肺常規通氣FEF25、FEF50、FEF75絕對值、預計值及其比值，并計算相應指標改善率=[(治療后數值-入組時數值)/入組時數值]×100%；治療3個月時做C-ACT或ACT哮喘控制評分，總分≤19分為控制差，≥20分為控制好。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 rs1063355、rs6906021位點基因型及等位基因分布：采用哈迪-溫伯格平衡定律檢驗rs1063355、rs6906021 SNP位點基因型分布，兩個位點基因型頻率均符合遺傳平衡定律(P>0.05)，說明樣本群體代表性較好。

2.1.1 rs1063355、rs6906021位點病例組與對照組基因型分布

rs1063355位點野生型為T/T型，變異型為T/G、G/G，對比野生型與變異型在病例組與對照組中的分布情況，未發現存在明顯的組間差異(χ2=0.335，P>0.05)；分別將病例組和對照組的野生型T/T與雜合子變異型T/G基因型頻率、野生型T/T與純合子變異型G/G基因型頻率比較，無統計學差異(χ2=0.000，χ2=1.580，P>0.05)，見表2。

rs6906021位點野生型T/T，變異型為T/C、C/C，對比野生型與變異型在哮喘組與對照組中的分布情況，發現病例組變異型頻率明顯高于對照組(χ2=5.293，P<0.05)。將病例組與對照組的野生型與兩種變異型基因型頻率對比，發現病例組變異型T/C與C/C基因型頻率均高于對照組(χ2=4.148，χ2=4.228，P<0.05)，見表2。

表2 病例組與對照組 rs1063355、rs6906021SNPs 基因型分布[n(%)]

2.1.2 rs1063355、rs6906021位點病例組與對照組等位基因分布

rs1063355位點T、G等位基因在病例組與對照組間分布無明顯差異(χ2= 2.821，P>0.05)；而rs6906021位點病例組與對照組T、C等位基因頻率有差異，病例組C等位基因頻率明顯高于對照組(χ2=4.611，P<0.05)，見表3。

表3 病例組與對照組 rs1063355、rs6906021SNPs 等位基因分布[n(%)]

2.2 rs1063355、rs6906021位點SNPs與兒童哮喘嚴重程度關系

rs1063355位點輕度組與中重度組間野生型T/T、變異型(T/G+G/G)頻率無明顯差異(P>0.05)，T/T與T/G及G/G基因型頻率無明顯統計學差異(P>0.05)，見表4。rs6906021位點輕度組與中重度組野生型與變異型基因型頻率無明顯差異(P>0.05)。T/T與T/C、C/C基因型頻率對比，無明顯差異(P>0.05)，見表4。

表4 輕度組與中重度組 rs1063355、rs6906021 SNPs基因型分布[n(%)]

對比rs1063355位點輕度組與中重度組兩種不同等位基因在分布上無明顯差異(χ2=0.722，P>0.05)，對比rs6906021輕度組與中重度組兩種等位基因型頻率亦未發現明顯差異(χ2=0.647，P>0.05)，見表5。

表5 輕度組與中重度組 rs1063355、rs6906021SNPs等位基因分布[n(%)]

2.3 rs1063355、rs6906021位點基因型與氣道功能指標變化間關系

分析對比氣道指標的實測值/預測值比值，FEF25野生型及變異型組改善率分別為(20.83±3.46)%、(18.12±4.36)%，組間差異無統計學意義(t=1.204，P>0.05)。野生型FEF50改善率為(16.09±5.48)%、變異型FEF50改善率為(30.35±9.46)%，野生型FEF75改善率為(25.38±11.26)%、變異型FEF75改善率為(36.83±17.40)%，變異型FEF50及FEF75改善率明顯高于野生型(t=-1.845、-0.847，P<0.05)，見圖3。

A：FEF25；B：FEF50；C：FEF75

FEF25、50、75野生型及變異型間改善率未見明顯差異(t=1.607、-1.323、-1.941，P>0.05)，其中FEF25野生型、變異型改善率分別為(18.44±5.39)%、(18.15±3.90)%；FEF50野生型、變異型改善率分別為(23.00±7.73)%、(27.96±11.02)%；FEF75野生型、變異型改善率分別為(29.01±9.24)%、(32.23±12.09)%，見圖4。

A：FEF25；B：FEF50；C：FEF75

2.4 rs1063355、rs6906021位點基因型及兒童哮喘控制情況

通過分析rs1063355位點野生型與變異型患兒哮喘控制情況，發現野生型哮喘控制情況優于變異型，但差異不明顯(χ2=0.526，P=0.677)，見表6；比較rs6906021位點野生型與變異型哮喘控制情況，發現變異型哮喘控制情況優于野生型，差異亦不明顯(χ2=0.130,P=0.757)，見表6。

表6 哮喘控制情況[n(%)]

3 討 論

HLA基因家族由定位于6號染色體短臂2區 1帶的人類主要相容性復合體基因簇編碼，總長度達3600 kb[10]。HLA基因家族編碼HLA復合體蛋白，參與抗原呈遞及免疫反應，與哮喘、過敏性皮炎發病有關[11]。HLA基因以Ⅰ、Ⅲ、Ⅱ類的順序在染色體上排列，其中Ⅱ類為決定免疫功能的主要區域。主要參與人類機體的免疫應答反應及相應調節，直接間接引起包括哮喘在內的多種免疫性疾病[12-13]。HLA-II類基因主要由 DR、DQ和 DP 3個亞型組成，其中DQ亞型組成之一為DQB1[11]325-339。

DQB1的基因片段覆蓋786 bp，參與261個氨基酸的編碼合成。Al-Timimi DJ等[14]人發現相對健康人活動性類風濕關節炎患者體內等位基因DQBI×06頻率更高，且越嚴重或活動性越高患者體內該等位基因頻率越高。此外，DQB1基因的變異還被發現可能會影響日本腦炎滅活疫苗誘導的中和抗體反應[15]，更加支持其在體內免疫調節中的作用。阿聯酋的研究[16]發現DQBI的多個等位基因、基因型及單倍型被證實與1型糖尿病有關，但卻未在歐、亞、非人群中確未發現，提示該基因與疾病關系在不同地區及民族中存在差異。

HLA-DQB1多態性與哮喘關系正成為研究熱點。1994年意大利Mapp等[17]對二異氰酸誘發的哮喘患者研究發現HLA-DQB1基因多態性與氰酸酯誘發的哮喘相關，韓國研究[18]同樣發現HLA-DQB1基因多態性與二異氰酸酯誘發的職業哮喘有關，Lara-marquez ML等[19]針對委內瑞拉人群研究發現，DQB1多態性可能與哮喘易感性相關，Suarez-Pajes E等[20]通過研究證實HLA-DQB1 rs1049213位點變異與哮喘風險顯著相關。本研究首次將HLA-DQBI rs6906021位點納入，檢測發現T和C兩種等位基因，與現有人類基因庫相同，野生型T/T，變異型為T/C、C/C。C等位基因組及攜帶C等位基因的變異型更易患哮喘，提示該位點可能為中國東北漢族兒童的哮喘易感位點，該位點多態性影響疾病臨床表型的機制尚待明確，猜測其多態性可影響與HLA相結合的抗原種類不同發揮作用，進而使遞呈至T細胞效率不同[21]，或影響TH1 /TH2細胞免疫反應平衡[22]，直接間接引起哮喘。rs1063355位點位于3’UTR區，有T、G兩種等位基因，G等位基因占比較高，構成野生型T/T，變異型T/G、G/G，然而本研究結果提示rs1063355 位點并非中國東北漢族哮喘兒童易感基因位點，然而美國維克森林大學醫學院的測序結果[23]卻與之相反，分析原因可能與納入對象的種族及國家不同有關，更證明其多態性研究在哮喘中意義。

ICS作為支氣管哮喘緩解期常用藥[2]1023-1048，能夠緩解氣道內炎癥及改善肺部氣道功能，實現哮喘有效控制，本研究未發現治療后不同基因型患者C-ACT/ACT評分存在顯著差異，但在肺功能指標研究中卻發現rs1063355位點變異型FEF50及FEF75實測值占預計值改善率明顯高于野生型，作為衡量小氣道功能指標的FEF50及FEF75，其實測值占預計值變化率出現基因型差異，提示該位點變異后的治療效果可能更好，這種變異可能導致了不同基因型間ICS的藥效差異，對臨床指導用藥方面存在一定價值。

現有研究集中于兒童哮喘疾病易感性，且種族、地域及表型異質性相對受限，本研究一定程度填補了空白，對篩選東北漢族兒童哮喘易感基因及臨床有一定意義，但不足之處是，需要增加樣本量或增加臨床指標維度進行研究。