反相高效液相色譜法測定土壤中多環芳烴

張會

（河北中天環保技術有限公司，河北 石家莊 050000）

0 引 言

多環芳烴是一類含有2 個或2 個以上苯環的碳氫化合物的總稱，屬于持久性有機污染物。迄今為止，人類已經發現200 多種多環芳烴，且相當數量的多環芳烴均具有致癌、致畸、致突變的“三致”特性，對環境的危害極大。

多環芳烴廣泛存在于大氣、水及土壤環境中，在多種環境介質中，土壤承擔了＞90%的多環芳烴的環境負荷，且多富集在表層。

1976 年，在國際癌癥研究中心（LARC） 列出的94 種對實驗動物致癌的化合物中，其中15 種屬于多環芳烴，農作物的營養積累主要通過吸收表層土壤中的養分來完成，所以，表層土壤中的多環芳烴通過生物轉化等途徑進入食物鏈，參與機體的代謝作用，對人體的生長、發育、神經及免疫系統產生毒副作用，從而誘發多種癌癥。

美國環保署（EPA） 已經將16 種對環境影響大的多環芳烴確定為優先控制環境污染物，而其中的萘、等8 種多環芳烴，更是被我國確定為建設用地土壤污染風險管控中的基本項目。

多環芳烴測定結果的準確性關系到土壤環境質量調查結果的可靠性，關系到被調查土壤的污染程度，關系到被調查企業的生死存亡，還關系到被調查土地的利用類型，及對周圍人群生存環境的影響。因此，提高土壤樣品中多環芳烴測定的準確性至關重要。

長期以來，各檢驗檢測機構對國產液相設備認可性較低，多環芳烴檢測更崇尚使用專用柱。

我國液相色譜儀產品研發起步晚，相比進口設備其檢測儀器的性能較差。因多環芳烴測定因子的較多，個別因子間分離度較差成為了各檢驗檢測機構崇尚使用進口設備和多環芳烴專用柱的主要原因。

但進口設備價格昂貴，多環芳烴專用柱為易耗品，且價格不菲，使用國產液相設備及普通C18反相色譜柱準確檢測土壤中多環芳烴，無疑是小檢驗檢測機構降低成本的有效方法。

本文使用國產Agress D1100 高效液相色譜儀（紫外檢測器） 及Supersil ODS2 5 μm C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，從設備條件設置方面著手，通過優化儀器設備條件，以提高多環芳烴測定的精密度和準確度，旨在證明國產液相設備及C18 反相色譜柱同樣能夠準確測定土壤中含有的多環芳烴。

1 主要儀器和試劑

1.1 儀 器

（1） Agress D1100 高效液相色譜儀。

（2） D1100 紫外檢測器。

（3） EclassicalW3200 工作站。

（4） AgressD1100 柱溫箱：大連依利特分析儀器有限公司。

（5） FA2004N 電子天平：上海菁海儀器有限公司。

（6） JL-180DT 脫氣裝置：上海吉理科學儀器有限公司。

（7） BSXT-02 索氏提取器：上海爭巧科學儀器有限公司。

（8） C181 000 mg 6 mL 硅膠固相萃取柱：泰州康之達實驗器材有限公司。

（9） LC-DCY-12G 氮吹濃縮儀：上海力辰邦西儀器有限公司。

（10） UPB-10 型高純水機：石家莊泰斯特儀器設備有限公司。

1.2 試 劑

（1） 乙腈（CH3CN）：HPLC 級，安徽時聯特種溶劑股份有限公司，批號為75-05-8。

（2） 正己烷（C6H14）：HPLC 級，天津市科密歐化學試劑，批號為20200310。

（3） 二氯甲烷（CH2Cl2）：HPLC 級，安徽時聯特種溶劑股份有限公司。

（4） 丙酮（CH3COCH3）：HPLC 級，歐普森，批號為D9002。

（5） 石英砂：100 ～20 目，天津科密歐化學試劑，批號為20210110。

（6） 多環芳烴標準儲備溶液：200 μg/mL，北京壇墨質檢科技有限公司，批號為1032007。

（7） 十氟聯苯標準貯備液（C12F10）：1 000 μg/mL，北京壇墨質檢科技有限公司，批號為A2101107。

（8） 無水硫酸鈉（Na2SO4）：天津市科密歐化學試劑，批號為20191203。

2 色譜條件

（1） 色譜柱：SUPERSIL ODS2 C18色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司。

（2） 進樣量：20 μL。

（3） 柱溫：35 ℃。

（4） 流動相A：乙腈；流動相B：水。

（5） 流速：1.0 mL/min。

梯度洗脫程序設置見表1。

表1 梯度洗脫程序設置Table 1 Gradient elution program setting

3 標準曲線繪制

用微量注射器移取適量的多環芳烴標準使用液，用乙腈稀釋，配制成質量濃度為0.04、0.10、0.50、1.00、5.00 μg/mL 的標準系列。

移取50.0μL十氟聯苯使用液加入到各標準系列中，使多環芳烴標準系列中十氟聯苯的質量濃度為2.00μg/mL。

按照上述2 色譜條件，從低濃度到高濃度依次測定，以濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，建立標準曲線（標準曲線線性范圍、線性方程、相關系數見表3）。

4 樣品制備

4.1 土壤樣品處理

4.1.1 樣品中多環芳烴的提?。?） 除去樣品中的樹枝、石子等異物。

（2） 稱取10 g（精確至0.01 g） 土壤樣品，加入無水硫酸鈉，研磨均化成流沙狀。

（3） 將試樣放入紙質套管內，加入50.0 μL十氟聯苯使用液，放入索氏提取器中。

（4） 再在索氏提取器中加入100 mL 丙酮- 正己烷混合溶液，以≥4 次/h 的回流速度提取16 h，即得到提取液。

4.1.2 提取液脫水和濃縮

（1） 在玻璃漏斗中鋪上玻璃纖維濾膜，并加入5 g 無水硫酸鈉，將提取液過濾到濃縮容器中。

（2） 用丙酮- 正己烷混合溶液洗滌提取容器，并沖洗玻璃漏斗，合并洗液至濃縮容器中。

（3） 用干式氮吹儀氮吹溶液，濃縮至1 mL。4.1.3 提取液凈化和溶劑轉換

（1） 將濃縮后的提取液移入硅膠固相萃取柱中，用3 mL 正己烷分3 次洗滌濃縮器皿。

（2） 將溶液移入硅膠固相萃取柱中，用10 mL 二氯甲烷- 正己烷混合液進行洗脫。

（3） 將洗脫液經干式氮吹儀濃縮至1 mL。

（4） 在濃縮液加入3 mL 乙腈，再次經氮吹濃縮至＜1 mL。

（5） 用乙腈準確定容至1 mL，待測。

4.2 空白樣品制備

稱取10 g 石英砂代替土壤樣品，按照與土壤樣品處理的相同步驟，進行多環芳烴空白試樣制備，得到凈化液1 mL，待測。

4.3 空白加標樣品制備

（1） 稱取10 g（精確至0.01 g） 石英砂（代替土壤） 共14 份，分為A、B 兩組，每組7 份。

（2） 分別將樣品放入研磨器中進行研磨，然后，放入紙質套管內。A 組中每份加入8 μL 多環芳烴標準使用溶液（濃度為20 μg/mL）；B 組中每份加入10 μL 多環芳烴標準使用溶液（濃度為20 μg/mL）。

（3） 按照上述4.1 土壤樣品處理的相同步驟，制備多環芳烴的空白加標試樣，即得到1 mL 的凈化液，待測。

4.4 土壤加標樣品的制備

4.4.1 高濃度加標土壤樣品

（1） 準確稱取10 g（精確至0.01 g） 土壤樣品，加無水硫酸鈉，研磨均化成流沙狀。

（2） 將試樣放入紙質套管內，加入20 μL 多環芳烴標準儲備溶液（濃度為200 μg/mL），按照上述4.1 土壤樣品處理的相同步驟，制備加標試樣，即得到1 mL 的凈化液，待測。

4.4.2 中濃度加標土壤樣品

（1） 準確稱取10 g（精確至0.01 g） 土壤樣品，加無水硫酸鈉，研磨均化成流沙狀。

（2） 將試樣放入紙質套管內，加入10 μL 多環芳烴標準儲備溶液（濃度為200 μg/mL），按照上述4.1 土壤樣品處理的相同步驟，制備加標試樣，即得到1 mL 的凈化液，待測。

4.4.3 低濃度加標土壤樣品

（1） 準確稱取10 g（精確至0.01g） 土壤樣品，加無水硫酸鈉，研磨均化成流沙狀。

（2） 將試樣放入紙質套管內，加入3 μL 多環芳烴標準儲備溶液（濃度為200 μg/mL），按照上述4.1 土壤樣品處理的相同步驟，制備加標試樣，即得到1 mL 的凈化液，待測。

5 結果與討論

5.1 檢測器及檢測波長的選擇

由于16 種多環芳烴中苊烯不適宜用熒光檢測器進行檢測，故本實驗采用紫外檢測器進行多環芳烴的檢測。

經資料查閱16 種多環芳烴及替代物十氟聯苯的最大吸收波長范圍為210 ～297 nm，經試驗對比，本實驗選擇檢測波長為220 nm，實驗證明色譜峰較高，且所有組分均能較好地達到基線分離。

5.2 流動相的選擇

甲醇的紫外截止波長為210 nm，乙腈的紫外截止波長為190 nm，甲醇的紫外截止波長距離檢測波長較近，低濃度時基線波動較大，影響方法檢出限，故本實驗選擇乙腈/水配比作為流動相。

本實驗考察了3 個水平（60%、70%、80%）的乙腈體積分數對分離的影響：

（1） 當乙腈體積分數為60%時，分析時間需65 min。隨著體積分數的增加，各組分的保留時間均縮短。

（2） 當乙腈體積分數為70%時，出峰時間比較理想，峰形對稱性好，且分離完全，多環芳烴各組分在45 min 之內就能完全分離。

（3） 當乙腈體積分數為80%時，分析時間更短，但色譜峰出現重疊。

所以，選擇流動相為乙腈∶水=70∶30。

5.3 流速影響

當流速太大時，各組份的保留時間均減小，導致色譜峰產生重疊；當流速太小時，分析時間長且拖尾，導致色譜峰擴寬。

本實驗考察了0.8、1.0、1.5 mL/min 3 個流速，當流速為1.0 mL/min 時，出峰時間和峰形都比較理想。

5.4 溫度的影響

保持恒定的柱溫有利于色譜的重現性。柱溫越高，出峰越快，柱效越高。但柱溫增高，會使分離度降低，而溫度太高，對色譜柱不利。

本實驗考察了30 ℃、35 ℃、40 ℃3 個溫度對檢測結果的影響，16 種多環芳烴各相鄰組分峰的分離度結果見表2。

表2 16 種多環芳烴各相鄰組分峰的分離度Table 2 Resolution of adjacent component peaks of 16 kinds of polycyclic aromatic hydrocarbons

由表2 可以看出，當柱溫為35 ℃時，不僅出峰時間較快，且相鄰峰的分離度均達到了比較理想的效果。

5.5 方法的線性關系

在最優化的色譜條件下，考察了16 種多環芳烴在0.04～5.00 μg/mL 范圍內的線性情況，16 種多環芳烴及替代物十氟聯苯均得到了完全分離。

16 種多環芳烴的色譜如圖1 所示。

圖1 16 種多環芳烴的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 16 kinds of polycyclic aromatic hydrocarbons

由圖1 可以看出，每種多環芳烴對應的峰面積與濃度的線性良好。

16 種多環芳烴的線性范圍、線性方程和相關系數見表3。

表3 16 種多環芳烴的線性范圍、線性方程和相關系數Table 3 Linear range,linear equation and correlation coefficient of 16 kinds of polycyclic aromatic hydrocarbons

5.6 方法檢出限和測定下限

方法檢出限和測定下限按照《環境監測分析方法標準制定技術導則》 HJ168-2020 附錄A 要求進行。

本實驗首先對4.2 中制備的空白樣品進行檢測，檢測結果為未檢出目標物質。

根據儀器響應（3 倍信噪比） 估計各多環芳烴的檢出限為4 μg/kg。

取10 g 石英砂，按照估計檢出限的4 倍對空白樣品進行加標處理，得到7 份4.3 中的A 組空白加標測試樣品，根據各組分檢測結果計算其標準偏差，并按照公式（1） 計算方法檢出限。

式中：S 為n 次測定的標準偏差；t 為當自由度為（n-1） 時，置信度為99%時的t 分布（單側）。

經測定16 種多環芳烴中，除菲、熒蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[ghi]苝、茚并[1,2,3-cd]芘外，其他目標物樣品的濃度均在3 ～5 倍計算出的方法檢出限范圍內。

調整空白加標樣品濃度后，得到7 份4.3 中的B 組空白加標測試樣品，根據各組分檢測結果計算標準偏差，并計算方法檢出限。經測定菲、熒蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[ghi]苝、茚并[1,2,3-cd]芘濃度均在3 ～5 倍計算出的方法檢出限范圍內。

實驗表明方法檢出限的測定結果有效，方法的檢出限及測定下限（n=7） 見表4。

表4 方法的檢出限及測定下限（n=7）Table 4 Detection limit and lower limit of determination of the method（n=7）

5.7 樣品分析和加標回收率及精密度

為確定上述分析條件下定量分析的精密度和準確度，本次試驗取某農田土壤實際樣品進行了檢測，經檢測該土壤樣品中多環芳烴各組分含量均低于方法檢出限，十氟聯苯回收率為93.8%～103%；制備該土壤樣品高、中、低3 個濃度的加標樣品，每個濃度的加標樣品制備6 個，具體制備方法見4.4。

對制得的加標樣品進行測定，根據測定結果計算標準偏差、相對標準偏差和加標回收率，結果見表5。

表5 土壤樣品的加標回收率及測定結果的精密度Table 5 Recovery rate of soil samples and precision of determination results

續表

6 結 語

使用國產Agress D1100 高效液相色譜儀（紫外檢測器） 及Supersil ODS2 5 μm C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），通過優化儀器設備條件，多環芳烴目標物分離效果良好，測定結果的精密度、準確度均能達到較高水平，能夠滿足土壤多環芳烴的測定要求。