基于CRISPR/Cas12a快速識別apxIVA的胸膜肺炎放線桿菌檢測平臺的建立

胸膜肺炎放線桿菌是引起豬急性呼吸道感染的重要病原菌之一，以急性出血性肺炎和慢性壞死性胸膜肺炎為主要特征。隨著我國集約化、工業化養豬模式的不斷發展，以及飼料中禁止添加抗生素政策的實施，都給該細菌性疾病的防控提出了新的挑戰。一旦豬只感染此病，生長發育速度變緩，飼料利用率變低，日增重及免疫抵抗力降低，其他生產性能也明顯下降，給世界養豬業造成了嚴重的經濟損失。

胸膜肺炎放線桿菌是革蘭氏陰性球桿菌，可以產生毒素。不同血清型分泌的外毒素種類不同，導致其毒力差異。已有研究表明現在分離鑒定的19 種血清型均可分泌毒素ⅠV 蛋白（ApxⅠV）。因此，apxⅠ-VA 基因也被認為是APP 感染臨床診斷的理想檢測靶點。對于APP 感染的鑒定，通常使用傳統的分離培養和分子生物學方法，而分離培養法相對耗時，因此人們更傾向于使用PCR 和qPCR 等分子生物學方法。但是，這兩種實驗室的常規技術，不僅要求昂貴的儀器設備，還需要操作熟練的專業技術人員，這給現地開展快速檢測帶來了一定的不便。

近期發表于《Frontiers in Microbiology》的“A CRⅠSPR/Cas12a-assisted rapid detection platform by biosensing the apxⅠVA ofActinobacillus pleuropneumoniae”一文介紹了一種快速識別胸膜肺炎放線桿菌核酸的快速檢測平臺，該方法將重組酶聚合酶擴增（RPA）與CRⅠSPR/Cas12a 快速識別系統相結合，并可依據檢測人員具備的硬件條件，通過3 種方法進行結果的判定，最終實現APP 感染的快速檢測。

RPA 反應依賴于多個酶的互相協同作用，反應過程無需精密的儀器設備，僅需要一臺恒溫設備（金屬浴或水浴鍋）在37 ℃～42 ℃下，即可完成對目標序列的指數擴增。CRⅠSPR/Cas12a 檢測系統主要是利用crRNA 引導的Cas12a 識別靶序列后激活的Cas12a 非特異性切割單鏈DNA（ssDNA）活性，當體系中兩端分別由熒光基團和淬滅基團修飾的ssDNA被切割后，即可釋放出熒光，進而實現快速檢測。整個檢測過程可以在1 h內完成。自從2018年Doudna 團隊 首 次 使 用CRⅠSPR/Cas12a 進 行HPV 的 快 速 檢測后，已有多個團隊開發出針對不同種人類和動物病原的快速檢測平臺，如Cas12aVDet、OCTOPUS 等。

該研究通過對crRNA、RPA 引物設計及篩選得到最佳檢測體系之后，以APP 現有的19 種血清型參考菌株和7 種常見的豬病病原和巴氏桿菌屬內的8種與APP 親緣關系較近的菌種的基因組為模板，進行了特異性分析，結果表明其對APP 具有高度特異性，沒有發現對其它病原的交叉污染；同時通過使用人工構建的載體和菌體進行了靈敏度的分析，結果顯示其最低檢出量為10 cfu/反應，與實驗室常用的qPCR 方法具有相似的靈敏度。而對于實驗室早期保存的肺臟樣品檢測時，表現出與傳統PCR 法高度的一致性。同時，在結果讀取時其可以在藍光儀激發條件下直接通過肉眼觀察，也可以通過酶標儀進行熒光值測定或使用免疫層析試紙條直接觀察。以上讀取方式的選擇，一方面取決于檢測人員現有的實驗條件，另一方面也需要結合檢測樣本的數量。盡管現階段其單次檢測成本高于常用的分子生物學方法，但對于滿足現場以及條件匱乏地區的APP 感染快速鑒定，無疑提供了一種候選方案。