Nrf2及其通路在膿毒癥相關性腦病中的研究進展

孟小舟綜述，張利東審校

0 引 言

大腦在膿毒癥期間耗氧量高，抗氧化、抗炎能力差，中樞神經系統易受到氧化和炎癥過程介導的損傷，因此高達70%的膿毒癥患者會進展至膿毒癥相關性腦病(sepsis-associated encephalopathy, SAE)。SAE不僅會增加死亡率和住院時間，還可能導致長期的身體和認知損傷，包括注意力、處理速度、聯想學習、視覺感知、工作記憶和語言記憶障礙[1]。據報道氧化應激、神經炎癥、神經元凋亡、血腦屏障完整性損傷或腦微循環障礙、氨基酸或神經遞質異常、線粒體功能障礙、腸道菌群移位等多種因素參與了SAE的發病機制，但具體機制尚未確定[2]。這些因素均可導致腦組織微環境的改變，進而增加海馬神經元興奮性毒性損傷引起認知功能障礙[3]。SAE的傳統臨床干預手段如使用抗菌藥物簡單且有限，效果差，預后差，目前研究證實通過抗氧化、抗炎等途徑可改善SAE患者的預后和認知功能。核轉錄因子-E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是調節哺乳動物的抗氧化反應和Ⅱ期解毒反應的重要轉錄因子，負責維持細胞氧化還原平衡。既往研究發現Nrf2作為最重要的內源性抗氧化因子，在多種神經退行性疾病中通過提高抗氧化防御能力發揮神經保護作用[4]?，F有研究表明Nrf2在SAE中介導抗氧化、抗炎等機制減輕SAE的腦損傷，改善SAE的預后和認知功能。深入研究Nrf2在SAE中的作用和調節機制，可為SAE的治療尋找新的干預靶點，有利于研發治療SAE的新型藥物。

1 SAE相關氧化應激機制

SAE的病理生理學是復雜和多因素的，包括許多相互交織的機制，如氧化應激、神經炎癥、神經元凋亡、血腦屏障完整性損傷和線粒體功能障礙等。其中，氧化應激(oxidative stress, OS)誘導的神經元凋亡在SAE的發病和進展中起著至關重要的作用，是大腦功能障礙的主要原因。氧化應激是全身炎癥反應的主要促進劑和介質，可導致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量產生和氧化因子、促炎因子的增加以及抗氧化系統的抑制，引起內質網應激、線粒體功能障礙、腦細胞鈣穩態破壞，影響神經膠質細胞、神經元和BBB的正常結構和功能，這在很大程度上導致與SAE相關的腦損傷和認知損傷，甚至導致SAE患者預后差以及死亡率增加[5]。除既往研究的MDA、SOD等氧化指標，臨床研究還發現SAE患者血漿和CSF中的抗壞血酸水平均顯著低于正常人，而CSF中抗壞血酸水平與神經系統癥狀的嚴重程度相關。而動物實驗揭示了GRK2、Ngb蛋白可能成為具有潛力的防治SAE的靶點，這些研究都表明抗氧化可能是治療SAE的有效途徑[6]。人體已進化出一個復雜的OS反應系統，在ROS作用下可誘導一系列保護蛋白來減輕氧化損傷，Nrf2/ARE是迄今為止發現的最重要的內源性抗OS信號通路，提示我們Nrf2有潛力預防或減輕氧化應激對SAE的影響。

2 Nrf2概述

Moi等[7]首先將Nrf2描述為β-珠蛋白基因表達的激活劑，后來將其描述為細胞內氧化應激的主要傳感器。Nrf2由7個具有不同功能的結構域組成[8]。Neh1結構域負責與小肌肉腱膜性纖維肉瘤蛋白(small musculoaponeurotic fibrosarcoma，sMaf)的結合和二聚以及核定位信號(nuclear localization signal，NLS)的調控，以增強Nrf2轉錄活性。Neh2結構域介導ETGE和DLG兩種基序結合Keap1調控Nrf2穩定性。Neh3、Neh4和Neh5結構域結合CREB結合蛋白CBP，增強Nrf2轉錄活性，Neh5結構域還負責調控Nrf2的細胞定位。Neh6結構域調控非Keap1依賴性的Nrf2降解，并結合β-轉導重復相容蛋白(β-TrCP)調控Nrf2穩定性。Neh7結構域直接結合Nrf2的抑制因子維甲酸X受體α(RXRα)，抑制Nrf2轉錄活性。Neh1-Neh7結構域共同構成Nrf2的結構基礎，調控數百個參與抗氧化反應的下游基因，包括抗氧化酶和Ⅱ期解毒酶。Nrf2在神經退行性疾病中上調抗氧化酶的表達、抑制神經膠質細胞介導的炎癥反應以及改善線粒體功能，提示Nrf2是一種靶向神經退行性疾病認知功能的治療途徑[9]。隨著對Nrf2的深入研究，發現Nrf2可參與調節未折疊蛋白反應、調節蛋白酶體活性、調節干細胞的增殖和分化等過程，提示Nrf2在中樞神經系統領域具有廣闊的研究前景。

3 Nrf2在SAE中的作用

SAE后腦組織中ROS和促炎因子增加，造成血管內皮細胞線粒體氧化應激和細胞凋亡，導致ROS和促炎因子進入腦組織中誘發神經元損傷，進而造成認知功能障礙。維持機體氧化還原平衡和恢復穩態的主要機制是Nrf2途徑，而Nrf2活性隨年齡的增長而下降是SAE的主要危險因素之一。Nrf2可減輕氧化應激損傷，并提高腦神經元存活率，保護人類或嚙齒動物來源的星形膠質細胞。敲除Nrf2導致SAE小膠質細胞和星形膠質細胞的海馬反應性膠質細胞增生增加，改變腦組織微環境和影響神經元結構和功能造成腦損傷導致認知功能障礙[10]。而激活Nrf2可上調抗氧化防御反應、降低炎癥反應、改善線粒體功能和維持蛋白質穩態來改善認知損傷[11]。研究發現Nrf2敲除小鼠易受LPS誘導的急性炎癥攻擊，而激活Nrf2可保護被LPS攻擊的小鼠免于死亡。陳鋒等[12]報道在LPS誘導SAE大鼠腦內氧化損傷過程中，腦組織中Nrf2 mRNA水平、Nrf2總蛋白水平以及p-Nrf2水平都顯著升高，同時上述水平的變化均與LPS具有劑量相關性，提示Nrf2以總蛋白水平與磷酸化水平兩種形式參與SAE氧化過程。所以，Nrf2可能通過增加mRNA和蛋白表達減輕SAE氧化損傷和認知損傷。

4 Nrf2相關信號通路對SAE的調節機制

4.1 Keap1/Nrf2/ARE通路Kelch樣ECH關聯蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)是一種富含半胱氨酸巰基的氧化還原損傷傳感器，已知錨定在肌動蛋白細胞骨架。Keap1與Nrf2相互抑制，在正常條件下，Keap1負調控 Nrf2并最終降解Nrf2。在氧化應激環境下，Nrf2因Keap1構象變化而與Keap1分離，并從細胞質易位到細胞核中與sMaf蛋白或轉錄因子C-JUN和JUND異源二聚化。異二聚體識別并結合ARE調節一系列編碼抗氧化酶、解毒酶、代謝改變酶和應激反應蛋白酶的表達，發揮抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗鈣超載等多種功能，在神經退行性疾病中發揮神經保護作用[4]。Keap1/Nrf2通路的分子激活和細胞保護活性由四個不同但相互關聯的成分組成：①Nrf2活性的化學激活劑；②這些激活劑的蛋白傳感器Keap1；③轉錄因子Nrf2調節對激活劑和氧化應激的轉錄反應；④提供該途徑的細胞保護輸出的靶基因。Keap1/Nrf2/ARE通路是機體最重要的抗氧化通路，是治療氧化應激和神經炎癥相關疾病的關鍵靶點。Cui等[13]證實GYY4137通過keap1的活化激活Nrf2/ARE通路，并在SAE小鼠體內發揮抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，從而保護血腦屏障的完整性，改善SAE的預后。ML385作為Nrf2抑制劑可直接結合到Nrf2的Neh1結構域，降低Nrf2轉錄活性，通過抑制抗氧化酶上調和增加凋亡蛋白表達逆轉了Nrf2/ARE通路對SAE小鼠的保護作用。因此Keap1/Nrf2/ARE通路作為預防和治療SAE的潛在靶點，在SAE中發揮著至關重要的神經保護作用。

4.1.1 Nrf2/HO-1通路血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)是一種具有細胞保護作用的抗氧化酶，可通過調節氧化損傷、減輕炎癥反應、拮抗細胞凋亡和促進血管生成而發揮神經保護作用[14]。Nrf2增加mRNA和蛋白表達誘導激活HO-1，神經元中HO-1增強了神經營養因子的上調，可以抵抗各種形式的細胞死亡,包括壞死、凋亡和新近發現的調節性細胞死亡(RCD)。Zakaria等[15]在LPS誘導SAE小鼠模型中發現LPS誘導 HO-1 mRNA 表達輕微增強，Ho-1酶活性下降，研究認為吡格列酮通過增強HO-1 mRNA的表達和恢復HO-1酶活性可改善LPS誘導的多巴胺能神經元丟失和神經行為障礙。Tang等[16]發現Nrf2/HO-1通路不僅可通過減少ROS的生成來發揮抗氧化保護作用，還可促使巨噬細胞/小膠質細胞從促炎M1表型到抗炎M2表型的極化，顯著降低促炎因子表達。Zhang等[11]在CLP誘導SAE大鼠模型中發現，維生素C增加海馬核和總Nrf2和 HO-1的表達，顯著降低血清及海馬中的TNF-α、IL-6、MDA含量以及海馬中的MMP-9活性，顯著升高血清及海馬中的SOD、IL-10濃度，提示靶向Nrf2/HO-1通路可減輕海馬組織病理改變，減輕全身炎癥和神經炎癥，改善血腦屏障通透性，抑制腦組織氧化應激來改善SAE認知功能。以上研究表明HO-1作為Nrf2下游蛋白可為SAE認知功能提供一種治療靶點。

4.1.2 Nrf2/GPX4通路谷胱甘肽過氧化酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)是生物抗氧化系統中抗氧化酶類的重要成員，可利用谷胱甘肽(glutathione，r-glutamyl cysteingl +glycine，GSH)的還原形式作為電子供體抑制脂質過氧化來減少氧化損傷。Ingond等[17]發現敲除GPX4會導致小鼠胚胎死亡，而表達低酶活性突變GPX4的小鼠在出生后第18天死于大腦過度氧化應激，表明GPX4對于防止氧化應激介導的神經元損傷至關重要。GPX4在細菌感染和多微生物膿毒癥中具有保護作用，可能成為開發有效控制感染和膿毒癥藥物的關鍵分子靶點。Kang等[18]發現GPX4及其減少脂質過氧化的能力對于小鼠巨噬細胞焦亡和膿毒癥致死率具有負性調節作用。這項研究首次揭示了GPX4通過抑制細胞焦亡在膿毒癥中的保護作用，這為開發有效的靶向脂質過氧化和促進GPX4活性治療膿毒癥奠定了基礎。Nrf2調控多種氧化基因的轉錄,這些基因參與了GPX4-GSH介導的鐵死亡防御。鐵死亡是一種由GSH合成中斷或GPX4抑制引起的細胞死亡機制，并伴隨著ROS的表達升高和線粒體功能障礙。姚鵬等[19]在LPS誘導SAE大鼠模型中發現Def組相比SAE組，海馬Nrf2、GPX4表達及血清鐵含量顯著增加，海馬NOX1、MDA、鐵含量及血清IL-6、NSE含量明顯降低，表明激活Nrf2/GPX4通路可降低大鼠海馬區鐵沉積和氧化應激水平，減輕神經元退行性變，明顯改善認知功能。以上結果表明Nrf2通過促進GPX4活性抑制氧化應激和鐵死亡并改善SAE相關神經元損傷。

4.2 Nrf2/NF-κB通路核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)調節ROS和促炎因子(細胞粘附分子1、IL-1β、IL-6、TNF-α等)的表達，因此可認為NF-κB啟動了膿毒癥炎癥級聯反應。Nrf2負調節NF-κB，Nrf2通過抗氧化反應降低細胞中ROS的表達減弱NF-κB的表達。NF-κB p65亞單位通過與CBP的CH1-KIX結構域或局部組蛋白低乙?；母偁幮韵嗷プ饔?，在轉錄水平上抑制Nrf2。Pan等[20]首次證明Nrf2和NF-κB之間相互作用，研究發現敲除Nrf2小鼠的星形膠質細胞的培養能夠增強依賴于經典的NF-κB通路的促炎因子的產生，這些促炎介質的過表達導致過多星形膠質細胞死亡加重腦損傷。Chen等[21]在CLP誘導SAE大鼠模型中發現SAE激活了Nrf2的表達，H2進一步增強了Nrf2的表達。H2可減輕SAE小鼠M1至M2表型的小膠質細胞/巨噬細胞極化，并減輕大腦皮層促炎因子的釋放，改善神經元損傷和認知功能，但Nrf2敲除小鼠沒有這種神經保護作用。P65是NF-κB異二聚體的亞單位，誘導NLRP3和IL-1β的轉錄。P65/NF-κB通過與NLRP3相互作用，在LPS刺激后誘導NLRP3的激活，而NF-κB抑制劑可顯著降低NLRP3的激活[22]。這項研究表明Nrf2/NF-κB通路與Nrf2/NLRP3通路協同作用共同參與調控SAE認知功能。

4.3 Nrf2/NLRP3通路NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)是腦損傷中含量最豐富的炎癥體，NLRP3激活caspase-1將前IL-1β轉化為生物活性IL-1β，從而啟動局部炎癥反應。炎癥反應促進ROS釋放，ROS作用于NLRP3的上游，并直接或間接地通過MAPK/NF-κB通路激活NLRP3活性，而LPS結合TLR4或感知病原體相關的分子模式增強NLRP3啟動和激活NLRP3炎癥體組裝來增強促炎反應[23]。Xie等[24]在CLP誘導SAE小鼠模型中發現SAE組小膠質細胞Nrf2和NLRP3的表達增加，MCC950作為NLRP3抑制劑可抑制SAE誘導的NLRP3的表達，減少IL-1β和IL-18的釋放以及改善神經元和線粒體功能。H2增加Nrf2的表達，抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達，減輕炎癥反應、神經元凋亡和線粒體功能障礙改善認知損傷，而Nrf2敲除小鼠則沒有這種神經保護作用。但炎癥體的異常激活與蛋白質錯誤折疊疾病有關，因此在將Nrf2作為SAE治療靶點之前，進一步研究Nrf2激活炎癥體功能的機制非常重要。

4.4 GSK-3β/Nrf2通路糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是調控非Keap1依賴性Nrf2穩定性的關鍵蛋白。GSK-3β介導DSGIS基序磷酸化后，Nrf2的Neh6結構域有效結合β-TrCP促進Nrf2蛋白酶體降解。GSK-3β可磷酸化Fyn，Fyn在病理條件下通過磷酸化、核輸出和蛋白酶體降解調節Nrf2表達。Zhu等[25]在LPS誘導SAE大鼠模型中發現異甘草素增加海馬突觸素、PSD-95、BDNF、SOD、GSH和BCL-2的表達,降低BAX、IL-1β、IL-6、TNF-α和C-C基序趨化因子配體3的表達，表明GSK-3β/Nrf2通路可能通過磷酸化依賴性失活GSK-3β，增強Nrf2反應性抗氧化酶和抑制NF-κB反應性促炎因子的表達，保護LPS誘導的神經元損傷和認知損傷。

4.5 SIRT1/Nrf2通路沉默調節蛋白1(Sirtuin 1，SIRT1)廣泛表達于中樞神經系統，催化非組蛋白和組蛋白脫乙?；瘉碚{節基因表達，參與腦生理功能的維持，表現出神經保護和抗炎作用。Xu等[26]在LPS誘導SAE大鼠模型中認為SIRT1可能是認知功能潛在的作用靶點。研究發現紅景天苷增加Sirt1、Nrf2的表達，上調SOD濃度，增加Bcl-2的表達，下調MDA活性，降低Bax、caspase-3和caspase-9的表達，表明SIRT1/Nrf2通路通過SIRT1激活Nrf2依賴性的抗氧化和抗炎活性來改善LPS引起的腦炎癥性損傷和認知損傷。

4.6 其他據報道Nrf2改善SAE認知功能的途徑還包括Nrf2/AQP4、PI3K/Akt/Nrf2等通路。Liu等[10]研究表明敲除Nrf2促進LPS誘導的AQP4表達增加，加重小鼠認知功能障礙；敲除AQP4可減少LPS誘導的神經炎癥改善小鼠認知功能，為SAE潛在的Nrf2/AQP4機制提供了證據。Liao等[27]研究發現丹參素冰片酯激活PI3K/Akt/Nrf2通路，誘導Nrf2和抗氧化酶表達均伴隨p-PI3K、p-Akt水平升高，改善LPS誘導的SAE認知損傷。以上Nrf2通路并非單獨存在，而是互相作用共同改善SAE預后和認知功能。Nrf2在SAE中的具體調節機制復雜，仍需要我們進一步研究探索。

5 Nrf2激活劑

5.1 動物實驗研究目前研究發現有不少藥物可治療嚙齒動物SAE，如富馬酸二甲酯、白藜蘆醇、姜黃素等傳統的Nrf2激活劑。在SAE模型中使用這些抗氧化劑介導Nrf2的激活，提高嚙齒動物的存活率，減輕多器官損傷和認知損傷。不同于傳統的Nrf2激活劑，Keap1-Nrf2 PPI抑制劑已成為激活Nrf2的一種新方法，可通過非共價相互作用競爭性地直接破壞Keap1-Nrf2 PPI，成為治療SAE的潛在藥物來改善認知功能。MSC外泌體是中樞神經系統疾病的強效抗炎納米治療劑[28]，MSC外泌體在體內外均能與海馬星形膠質細胞結合，減輕炎癥反應，改善LPS誘導的線粒體功能障礙[29]，表明外泌體可能作為Nrf2激活劑改善SAE認知功能。MSC外泌體因其高安全性和多靶點效應，使其在膿毒癥及認知功能障礙的治療中引起廣泛的研究興趣。Nrf2在SAE動物模型中的作用及其機制的研究為臨床研究提供理論依據，有利于研發新型高效的Nrf2激活劑，但Nrf2激活劑或與其它治療SAE藥物結合的臨床療效需要進一步通過臨床研究來確定。

5.2 臨床研究目前許多傳統的Nrf2激活劑正在進行臨床研究，如DMF、SFN、CDDO-Me、Oltipraz，且Keap1-Nrf2 PPI抑制劑的研發也已取得顯著進展。目前Nrf2激活劑有以下問題亟待解決[30]:①親電Nrf2激活劑的潛在缺陷是會與除Keap1外的蛋白質中的氧化還原敏感半胱氨酸發生反應表現出脫靶效應，表現為對Keap1的選擇性可能不高，因此應研發具備靶向選擇性的Nrf2激活劑；②大多數Keap1-Nrf2 PPI抑制劑含有極性基團，通常導致血腦屏障穿透性差，如何提高體內療效和穿透血腦屏障到達中樞神經系統是一個挑戰；③Nrf2可能是癌癥進展、轉移和耐藥性的驅動因素。應用Nrf2激活劑來對抗炎癥可能會導致Nrf2下游基因的異常表達，從而誘導腫瘤發生和對放化療的抵抗。由于在膿毒癥治療中僅急性使用Nrf2激活劑，所以Nrf2的致癌潛力可以忽略不計。因此應開發高度特異性的Nrf2激活劑，以盡量減少其多效性效應。目前還沒有關于Nrf2激活劑在SAE患者中的臨床試驗[31]，因此需要Nrf2在SAE領域的臨床前和臨床研究。

6 結 語

深入研究發現Nrf2在SAE中的作用越來越突出，未來研究目標是研究Nrf2在SAE中的具體調節機制，將Nrf2及其下游靶蛋白的表達水平作為預測和診斷SAE的指標。此外，針對Nrf2相關通路的靶點研發藥物治療SAE患者具有廣闊的臨床應用前景。當前SAE研究面臨高度異質性和難以轉化為臨床實踐的困境，而新冠肺炎的研究涉及Nrf2的預防策略，以防止病毒攝取、DNA或RNA復制和細胞因子表達為主題，這可能是突破SAE臨床治療瓶頸的重要途徑。