基于重水拉曼技術評價次氯酸鈉對糞腸球菌抑菌效能的研究

馬玉瑩蘆昕張利娟劉育含李帆譚凱璇張穎李修珍楊芳

1.青島市市立醫院口腔醫學中心，青島266071；2.大連醫科大學口腔醫學院，大連116044；3.臨沂市婦幼保健院口腔科，臨沂276002；4.青島大學口腔醫學院，青島266000；5.天津醫科大學口腔醫學院，天津300070

根管治療是牙髓炎和根尖周炎最有效、最常規的治療方法，而根管治療的成功與否取決于根管內的感染物能否徹底清除以及根管內感染能否得到控制。其中，糞腸球菌被認為是與根管感染相關的主要病原體[1]，有效抑制糞腸球菌在根管治療的成功中就顯得尤為重要。

盡管根管機械預備技術已相當成熟，但仍有至少35%～50%的根管壁難以被器械預備[2]，無法達到徹底清除根管系統內感染物質的目的，還需輔以沖洗液的機械或化學作用來達到。次氯酸鈉是臨床常用根管沖洗液，有良好的組織溶解能力和抗菌能力[3]，其常用質量分數為0.5%～5.25%。

目前評價藥物對病原微生物作用效果的“金標準”是通過最小抑制濃度（minimum inhibitory con‐centration，MIC）對目標藥物進行定量評價[4]。傳統藥物評價技術主要作用于細胞群體水平，忽略了細胞異質性，而藥物作用下產生的細胞異質性則是致病菌產生耐藥的基礎。病原菌的異質性水平必須降低到一定水平才能保證抗菌劑良好的作用效果。最小抑菌濃度的測定僅能考察微生物生長抑制效果，而未考慮細胞活性，忽略了不生長但具有代謝活性（nongrowing but metabolically active，NGMA）的持留菌群體。細胞異質性和細胞代謝活性的存在正是導致耐藥性及疾病復發的重要因素[5]。

重水拉曼技術是一種不依賴細胞培養的、在單細胞水平上，快速、定量、無損、高通量的評價抗菌劑對目標微生物的代謝抑制效果的技術手段，并已應用于臨床藥物評價篩選、微生物種類鑒別[6]等領域。Tao等[7]采用重水拉曼技術在單細胞水平表征不同口腔抑菌劑對變異鏈球菌UA159、血鏈球菌ATCC10556等多種細菌代謝活性的影響，證實了拉曼光譜中的重水峰[（C-D峰）2 040～2 300 cm-1區域]是細胞生理代謝活性的生物學指示標志，其所占比例可用于分析藥物刺激目標菌株后的代謝反應；并提出最低抑制代謝濃度（mini‐mum inhibitory concentration based on metabolic ac‐tivity，MIC-MA）[使目標菌株在藥物作用8 h后的ΔC-D-ratio（當前時間與0 h的C-D ratio（重水峰所占面積）差值）均值≤0且標準差≤0.005的最小藥物濃度]評價抗菌劑對目標菌種的代謝抑制作用，為重水拉曼技術研究抗菌藥物對病原菌的功能抑制作用提供理論和數據支持。

隨著各種抗菌劑的廣泛應用，細菌耐藥性問題已經嚴重影響到傳統藥物對相關疾病的治療效果，甚至產生超級病原菌，嚴重威脅人類健康[8]。為了減少根管封藥菌株的產生、根管治療失敗及難治性根尖周炎的發生，降低高濃度用藥導致的毒副作用，指導臨床合理用藥，單細胞藥物評價系統成為大勢所趨。本實驗采用糞腸球菌作為實驗菌株，研究重水對糞腸球菌生長的影響及其對重水的吸收規律，評價重水拉曼技術的普適性，并應用重水拉曼技術評價次氯酸鈉對糞腸球菌生長和代謝的抑制效果。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株

實驗菌株糞腸球菌ATCC29212購自中國醫學菌種保藏中心，甘油菌種于-80℃條件下儲藏。

1.2 材料和儀器

5.25%次氯酸鈉（福建維真園醫藥科技有限公司）；全自動生長曲線分析儀（Lab systems公司，芬蘭）；超凈工作臺（Thermo Scientific公司，美國）；電熱恒溫培養箱（Shelab公司，美國）；96孔板（Corning公司，美國）；酶標儀（BioTek公司，美國）；共聚焦顯微拉曼光譜儀（Horiba公司，法國）；CaF2玻片（Crystran limited公司，英國）；99.99%D2O（Sigma-Aldrich公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 重水標記的糞腸球菌生長周期觀察 1）將凍存的糞腸球菌ACTT29212劃線接種于腦心浸液肉湯（brain heart infusion，BHI）培養基表面，于37℃培養24 h后貯藏在4℃條件下。2）挑取糞腸球菌ATCC29212單克隆菌落接種于5 mL BHI培養液中，37℃培養至對數生長期，用BHI培養液調整菌液濃度至OD600=0.5。3）將培養至對數生長期的糞腸球菌ATCC29212按照體積比1∶10分別接種于含不同重水濃度（0%、10%、20%、30%、40%、50%）的BHI培養液中（0%為對照組），37℃條件下每隔15 min定時測定菌液樣本的OD600值，設定觀測時間段為0～12 h。實驗重復3次，每次每個時間點設置3個生物學平行。

1.3.2 圖譜中重水峰面積與所加重水濃度的關系研究 糞腸球菌ATCC29212培養同前。將培養至對數生長期，OD600=0.5的糞腸球菌ATCC29212按照體積比1∶10分別接種于含不同重水濃度（0%、10%、20%、30%、40%、50%）的BHI培養液中（0%為對照組），37℃條件下培養12 h，每個重水濃度分別隨機測定30個單細胞拉曼圖譜。實驗重復3次。

拉曼圖譜采集：使用基于LabRam HR型的改良后共聚焦拉曼熒光顯微鏡，采用532 nm的Nd:YAG激光源，使用Newton EMCCD采集散射光子，采用每毫米300線規格的分光光柵，在100倍物鏡視野內隨機采集30個單細胞拉曼圖譜。

1.3.3 重水拉曼技術評價藥物抑菌效能的敏感性分析 糞腸球菌ATCC29212培養同前。將培養至對數生長期，OD600=0.5的糞腸球菌ATCC29212按照體積比1∶10接種于含30%重水的BHI液體培養基中，37℃條件下培養，時間梯度上（0、0.5、1、2、3、4、6、8 h）按照每個時間點進行取樣，采集拉曼圖譜及測量OD600值。實驗重復3次。

1.3.4 次氯酸鈉對糞腸球菌的MIC測定 糞腸球菌ATCC29212培養同前，將對數生長期的糞腸球菌ATCC29212菌液調整濃度至OD600=0.5。于超凈臺內打開無菌96孔板，將所獲菌液加入不同濃度（0.2、0.4、0.45、0.6、0.9、1、1.8 g·L-1）次氯酸鈉實驗組及對照組（不含次氯酸鈉）中，每孔內液體總體積為200μL，37℃培養24 h，使用酶標儀測定0 h和24 h時的OD600值，測定次氯酸鈉作用后的MIC值，ΔOD600≤0.05時對應的最低藥物濃度，即次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC29212的MIC[9]。實驗重復3次。

1.3.5 次氯酸鈉對糞腸球菌的MIC-MA測定 糞腸球菌ATCC29212培養同前。將對數生長期的糞腸球菌ATCC29212菌液調整濃度至OD600=0.5。將所獲菌液按1∶10比例稀釋至含有0 g·L-1、0.225 g·L-1（0.5×MIC）、0.45 g·L-1（1×MIC）、0.9 g·L-1（2×MIC）濃度次氯酸鈉和30%重水的BHI培養基中，37℃恒溫培養，0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8 h時間梯度取樣。

獲得的樣品經200μL超純水洗滌，離心后棄上清，此操作重復3次。然后使用超純水重懸糞腸球菌細胞后取2μL稀釋液點在CaF2玻片表面，超凈臺內自然風干，100倍物鏡下在不同視野內隨機收集測量約30個單細胞拉曼圖譜。

將采集到的拉曼光譜用LabSpece 5軟件進行拉曼圖譜的背景去除、基準線歸一化和最大值標準化處理后，即可計算圖譜中重水峰面積。通過計算8 h和0 h的重水峰所占面積的差值得到ΔC-D ratio，當ΔC-D ratio≤0且標準差≤0.005時對應的最低藥物濃度即為次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC29212的MIC-MA[7]。實驗重復3次。

為進一步探究糞腸球菌ATCC29212的代謝活性是否會隨培養時間的延長而升高，本研究將糞腸球菌ATCC29212的培養時間延長至24 h，并繪制了平均重水峰所占面積隨時間變化的折線圖。

1.4 統計學分析

實驗中定量數據均采用“均數±標準差”表示。采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，統計方法采用T檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。實驗結果采用R（3.6.1版本）軟件包進行統計學分析，由于拉曼圖譜包含多個數據點為多維數據，因此拉曼圖譜之間的比較采用Wilcoxon秩和檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 重水標記糞腸球菌生長周期的觀察結果

將糞腸球菌ATCC29212暴露于含不同重水濃度的培養基中分別測定OD600值，與未加重水的對照組相比，培養基中重水濃度≤40%時，糞腸球菌ATCC29212的生長不會受到抑制（P>0.05）；濃度在50%時，糞腸球菌ATCC29212的生長受到一定程度抑制（P=0.028，P<0.05）（圖1）。因此，當重水濃度低于40%時，重水的毒性不成為本實驗的限制因素。

圖1 糞腸球菌ATCC29212在不同重水濃度下OD600隨時間的變化Fig 1 The temporal change of OD600 for Enterococcus faecali s ATCC29212 under different D2Olevels

2.2 圖譜中重水峰面積與所加重水濃度之間關系的研究結果

除不含重水的對照組外，不同濃度重水培養的糞腸球菌ATCC29212的拉曼圖譜在2 040～2 300 cm-1區域均會出現重水峰（圖2），且重水峰大小隨重水濃度的增加而增加，重水峰所占面積與所加入重水濃度呈線性正相關關系（R2=0.958 5，P<0.001）（圖3）。該結果表明：糞腸球菌ATCC-29212能夠活躍代謝重水并通過拉曼圖譜檢測出來，因此本研究選擇既不影響糞腸球菌ATCC-29212生長狀態，又能顯示出明顯重水峰的重水濃度——30%作為后續實驗的重水濃度。

圖2 糞腸球菌ATCC29212的單細胞拉曼圖譜Fig 2 The single cell Raman spectrum of Enterococcus faecali s ATCC29212

圖3 穩定期糞腸球菌ATCC29212單細胞拉曼圖譜中重水峰所占面積與重水濃度之間關系Fig 3 Therelationshipbetween C-Dratioand D2Oconcentrationin SCRSof Enterococcusfaecali sATCC29212atstablephase

2.3 重水拉曼技術評價藥物抑菌效能的敏感性分析結果

隨著糞腸球菌ATCC29212在含有30%重水培養基中培養時間的延長，重水峰的強度如圖4所示，單細胞拉曼圖譜中重水峰所占面積與OD600隨時間變化趨勢如圖5所示?；诖x活性的重水峰幾乎在加入30%重水后的即刻就出現，并在30 min時即差異有統計學意義（P<0.01）；而基于生長的吸光度值OD600的明顯變化在3 h后才出現。因此基于代謝活性的技術手段較為敏感。

圖4 糞腸球菌ATCC29212在30%重水濃度下隨時間變化的單細胞拉曼圖譜Fig 4 The temporal change of SCRS for Enterococcus faecali s ATCC29212 under 30%D2O

2.4 次氯酸鈉對糞腸球菌的MIC測定結果

次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC29212的MIC測定結果顯示：在次氯酸鈉濃度分別為0.2、0.4 g·L-1時，ΔOD600>0.05；在次氯酸鈉濃度為0.45、0.6、0.9、1、1.4、1.8 g·L-1時，ΔOD600<0.05。因此，次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC29212的MIC為0.45 g·L-1。

2.5 次氯酸鈉對糞腸球菌的MIC-MA測定結果

次氯酸鈉對糞腸球菌的MIC-MA測定結果表明：次氯酸鈉濃度在0.225 g·L-1（0.5×MIC）及0.45 g·L-1（1×MIC）時，ΔC-D-ratio>0；次氯酸鈉濃度在0.9 g·L-1（2×MIC）時，ΔC-D-ratio<0且標準差<0.005，ΔC-D ratio值明顯降低（P<0.001）。因此，糞腸球菌ATCC29212的MIC-MA為0.9 g·L-1，即2×MIC。

隨著次氯酸鈉藥物濃度的升高，ΔC-D-ratio呈下降趨勢，表現為負相關關系。當藥物濃度達到MIC-MA時，絕大多數糞腸球菌ATCC29212進入小于0的“代謝靜止區”，而在MIC濃度下，大部分細菌細胞沒有進入“代謝靜止區”，仍存在代謝活性（圖6）。

圖6 次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC29212的MIC-MA測定Fig 6 The measurement of MIC-MA of NaClO for Enterococcus faecali s ATCC29212

拉曼圖譜中重水峰所占面積的時間動態變化曲線顯示（圖7），次氯酸鈉濃度為MIC時，雖然重水峰的增長低于未加藥的對照組，且保持在一個較低的水平，但8 h時的重水峰較0 h時高，將糞腸球菌ATCC29212的培養時間延長至24 h后，結果顯示（圖8），MIC濃度次氯酸鈉刺激下的糞腸球菌ATCC29212的重水峰所占面積大幅回升，達到對照組的93%；而藥物濃度在MIC-MA時，糞腸球菌ATCC29212的代謝活性在24 h內始終保持在基線水平。

圖7 8 h內糞腸球菌ATCC29212在不同濃度次氯酸鈉作用下重水峰所占面積的時間梯度曲線Fig 7 Temporal dynamics of C-D ratio of Enterococcus faecali s ATCC29212 under different concentrations of NaClO in 8 h

圖8 24 h內糞腸球菌ATCC29212在不同濃度次氯酸鈉作用下重水峰所占面積的時間梯度曲線Fig 8 Temporal dynamics of C-D ratio of Enterococcus faecali s ATCC29212 under different concentrations of NaClO in 24 h

3 討論

本研究測定了次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC-29212生長及代謝的影響，建立了抗菌劑對細菌代謝活性的作用模型，評價了重水拉曼技術的先進性、優越性及可靠性，為后期評價抗菌劑對細菌作用效能等方面的研究提供了新思路及理論依據。

傳統藥物評價系統多是依賴細胞生長的、微生物群體水平上的檢測手段，不僅耗時長、對難以培養的細菌束手無策、忽略了細胞間的異質性是產生耐藥性的基礎，而且無法研究微生物群體中小部分NGMA狀態的持留菌細胞。持留菌是細菌中普遍存在的，處于休眠狀態的一類特殊小亞群。它們通過降低代謝活性和生長速率，進入代謝性休眠的非分裂狀態來抵抗致死濃度抗菌劑的威脅，維持自身的生存，其代謝活動隨著外界環境的變化而變化[10]。持留菌對逆境的不應答性和代謝活動的變化使其能夠耐受不利環境而存活，這種細菌的持留性在感染的復發及慢性感染中扮演著重要角色[11-12]，而且與細菌耐藥性的增加有關[5,13]，它們的存在增加了細菌感染治療的難度。若糞腸球菌以低代謝活性的狀態在根管中長時間存留，則可能導致根管治療失敗及難治性根尖周炎的發生[14-16]。因此，停留在抑制細菌生長層面的研究已無法滿足現代化臨床治療的需要。

隨著細菌耐藥問題的日益嚴峻，人們急需新型抗菌劑及新的藥物評價手段來幫助臨床合理用藥。目前，單細胞技術評價細菌對藥物刺激的反應主要是通過熒光標記法，通過研究某個基因以及下游表達產物在藥物刺激下的表型來評價藥物作用效果。而熒光標記技術需要外源性標記物，會干擾細胞正常生理功能。單細胞拉曼技術雖無需外源性標記且能夠反映細胞分子生物學構成，但拉曼光譜也存在著對細胞基因學背景、生理學狀態及環境因素等極度敏感等缺陷。因此，本課題組發展了一種重水同位素標記技術與單細胞拉曼技術聯合應用的技術手段，基于抗菌劑作用下細菌對重水的代謝差異，在單細胞水平上揭示細菌代謝活性的信息，實現對抗菌劑作用效能的快速判定，評價藥物作用效果。

重水中的D+能夠被有代謝活性的微生物細胞通過置換NADPH中的H+來合成細胞內的大分子物質，從而在拉曼圖譜中2 040～2 300 cm-1的區域出現重水峰，通過分析重水峰所占面積即可表征藥物作用后細菌單細胞水平上的代謝活性，評價藥物抑菌效能[6-7]。不僅如此，單細胞拉曼技術還具有非常廣泛的應用前景，拉曼圖譜理論上可以涵蓋細胞內全部物質的圖譜，尤其是600～1 800 cm-1的“指紋區”涵蓋著豐富的生物信息，根據不同峰的變化可以實現對細胞類型的快速區分或細胞對不同刺激反應的區別和分類[17]。

重水拉曼技術作為一種評價抗菌劑對目標微生物的代謝抑制效果的技術手段，采用重水作為標記物，其特點為不依賴細菌生長、快速、定量、無損、高通量。細菌在含重水的培養基中培養0.5 h即可測得明顯重水峰，8 h內即可快速鑒定篩選對目標菌株有效的抗菌劑。與傳統依賴細胞生長的藥物評價方法相比，可更快更準確地評估藥物作用后細菌細胞的代謝水平，降低疾病的復發率[7,18]，為持留菌的臨床防治提供新思路。

本研究探究了糞腸球菌ATCC29212在不同濃度重水中的生長狀態及對重水的吸收規律，結果顯示，8 h內培養基中重水濃度為30%時，糞腸球菌ATCC29212的生長狀態不會受到抑制（P>0.05），細胞可穩定代謝重水，在拉曼圖譜2 040～2 300 cm-1區域出現明顯重水峰，且重水峰的時間變化趨勢易被檢測到，因此選取30%濃度重水用于重水拉曼技術定量檢測抗菌劑對糞腸球菌ATCC-29212抑菌效能的研究。后續實驗評價了次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC29212的抑菌效能，通過肉湯稀釋法測定了其MIC，基于重水拉曼技術測定其MICMA，結果顯示，MIC-MA值為MIC值的2倍。往期研究也得到了類似結果，Tao等[7]在探究口腔抑菌藥物對變異鏈球菌抑菌效果時發現，氟化鈉與氯己定對變異鏈球菌的MIC-MA值均高于MIC值，分別為3×MIC和2×MIC。證明藥物在傳統MIC濃度時雖抑制了細胞生長，但仍不能完全抑制目標細菌的代謝活性，24 h時該菌代謝活性的大幅回升也證明了這一點，細胞仍可進行代謝活動從而對人體產生危害；而在MIC-MA濃度下，細菌細胞的生長與代謝在一定時間內均被完全抑制。這充分顯示了重水拉曼技術對于研究不生長但有代謝活性細胞的獨特優勢。

本研究發現，即使是較高的MIC-MA濃度也遠低于次氯酸鈉的臨床常用濃度，但這一實驗數據是在細菌純培養條件下獲得的，而牙髓感染通常是多種細菌導致的混合感染[19]。細菌在根管系統中主要以生物膜的形式存在，由于生物膜獨特的三維立體結構和其中因受到營養物質限制而處于緩慢生長或不生長狀態的細胞等因素[20]，導致以生物膜形式存在的細菌較浮游菌的耐藥性強100～1 000倍[21]。本實驗僅以次氯酸鈉對浮游狀態的糞腸球菌ATCC29212的抑菌效能為例，通過單細胞拉曼光譜實時探討了藥物的抗菌特性，建立了重水拉曼技術對抗菌劑作用效果評估的模式體系。后續重水拉曼技術憑借其快速、準確的突出優點，可作為一種普適性的、無損且定量的抗菌劑評價手段，進一步研究多菌種生物膜狀態下菌群對抗菌劑的反應，以更好地指導臨床合理用藥，避免高濃度用藥及藥物濫用對人體的不良反應、減少耐藥菌株的產生，為精準醫療奠定基礎。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。