Smyd2基因敲除加重壓力超負荷誘導的病理性心肌肥厚*

李 威 石紅杰 周 妍 胡宇峰 夏 豪

(1.武漢大學人民醫院心血管內科，武漢 430060)(2.武漢大學模式動物研究所，武漢 430071)

病理性心肌肥厚是多種心血管疾病的重要臨床階段，其主要原因為機械性或體液性因素導致的壓力負荷持續性增大，造成心肌細胞肥大以及心肌間質纖維化，最終導致心臟功能嚴重受損，以及不可逆轉的病理性心臟重構和心力衰竭[1]。在病理性心臟重構過程中，多種基因及信號傳導通路參與調控心肌肥厚和纖維化病理生理過程[2-5]。Smyd2屬于組蛋白甲基轉移酶SMYD家族，通過基因表達的表觀遺傳調控參與多種疾病的發生發展過程[6]。Smyd2是最廣泛研究的賴氨酸甲基轉移酶之一，它可以甲基化修飾組蛋白H3K6、H3K4以及其他非組蛋白靶標，進而調控基因轉錄和表達[7]。此前研究表明，Smyd2通過調控基因轉錄，促進多種腫瘤，如肺癌、結腸癌和宮頸癌等的發生發展[8-10]。此外，Smyd2在心臟組織中高度表達，目前的研究對于Smyd2在心臟中的功能知之甚少[11]。對于Smyd2在病理性心肌肥厚中的作用尚不明確。因此，本研究成功構建了Smyd2基因敲除的小鼠，并建立壓力負荷誘導的病理性心肌肥厚模型，以探究Smyd2在心肌肥厚和纖維化中的調控作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究選用8～10周齡、體質量24～26 g、C57BL/6背景的雄性小鼠作為實驗對象。Smyd2基因敲除(Smyd2-KO)小鼠為本實驗室構建，對照組為C57BL/6背景的雄性同窩對照小鼠(WT)。小鼠的飼養和繁殖均在武漢大學模式動物研究所SPF級動物房，實驗動物生產許可證號【SCXK(鄂)2019-0004】，實驗動物使用許可證號【SYXK(鄂)2019-0013】。所有動物實驗均經過武漢大學人民醫院實驗動物倫理委員會審查并獲得倫理批準，倫理審批號【WDRM動(福)第20201206號】。

1.2 實驗主要試劑

戊巴比妥鈉(Sigma Aldrich公司，P3761)、細胞核染料(Southern Biotech公司，0100-20)、蘇木精染液(谷歌生物公司，G1004)、伊紅染料(BASO公司，BA-4024)、天狼星紅染料(海德創業生物科技公司，26357-02)、MEGAshortscript試劑盒(Ambion公司，AM1345)、miRNeasy Micro Kit(Qiaen公司，217084)。

1.3 實驗儀器

獨立送回風凈化籠具(蘇杭科技器材有限公司)、溫控手術臺(WPI公司，ATC100)、臺式離心機(Thermo公司，LEGNED MICRO17)、多功能脫色搖床(上海智誠公司，ZWY-344)、凝膠成像系統(伯樂公司，Gel DocTM)、PCR儀(ABI公司，Verti)。

1.4 Smyd2基因敲除小鼠的構建及鑒定

Smyd2基因敲除小鼠運用CRISPR-Cas9技術成功構建。首先，在http://crispr.mit.edu上在線預測小鼠Smyd2的引導序列并設計了兩條sgRNA，sgRNA1∶5’-GATGCCGGGATGCGGATATAGGG-3’，sgRNA2∶5’-GTGGCTGGGGATCATGCCGAGGG-3’。通過引物退火得到雙鏈DNA，將雙鏈DNA克隆到pUC57-sgRNA(Addgene，51132)載體上，然后以上述載體為模板通過PCR擴增得到含有T7啟動子及引導序列的DNA片段。擴增使用引物為正向引物：5’-GATCCCTAATACGACTCACTATAG-3’，反向引物：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGT-3’。以上述步驟得到的PCR產物和Cas9質粒(Addgene，44758)作為模板用MEGAshortscript試劑盒(Ambion，AM1345)分別進行體外轉錄。將轉錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA用miRNeasy Micro Kit(Qiaen，217084)純化后通過FemtoJet5247顯微注射系統注射到野生型C57BL/6小鼠的單細胞受精卵內。選取經顯微注射后存活的受精卵移植到健康雌鼠輸卵管中，妊娠得到F0代小鼠。將F0代小鼠和野生型C57BL/6小鼠雜交得到F1代小鼠，然后用PCR鑒定小鼠基因型，將雜合子雜交并鑒定篩選得到純合子小鼠。PCR鑒定引物為：Smyd2-正向：5’-CTTCCCATCTCAAACGGTTC-3’，Smyd2-反向：5’-AACTTGGCTGATGGTGTCCT-3’。本研究中所用小鼠均為純合子。

1.5 動物模型建立

分別將10只WT和Smyd2-KO的小鼠進行主動脈弓縮窄術(TAC)，建立壓力超負荷誘導的心肌肥厚模型[12-14]。首先，用3%戊巴比妥腹腔注射進行小鼠麻醉，沿第2～3肋間切開皮膚并分離肌肉以及軟組織，然后用解剖剪剪斷右鎖骨，游離主動脈弓，隨后用7-0手術縫線穿過26 G墊針結扎主動脈。依次縫合切口，將小鼠置于恒溫箱中，蘇醒后將小鼠放回于飼養室繼續飼養觀察。

1.6 超聲檢測

TAC術后4周，用異氟烷麻醉小鼠后，將小鼠固定為左側臥位或仰臥位，在左胸前區做剃毛處理，然后涂抹超聲耦合劑在剃毛區。采用高頻超聲診斷儀設置超聲頻率為15 MHz，選取標準左室乳頭肌短軸切面進行超聲檢測，測量并計算左室舒張末期內徑、左室收縮末期內徑、短軸縮短率以及射血分數。

1.7 組織病理學檢測

超聲檢測完成后，稱重后處死小鼠，快速取出心臟組織，用10倍體積的4%多聚甲醛固定24 h，切除心房組織，依次進行脫水、石蠟包埋、切片處理。隨后分別進行蘇木精-伊紅(HE)和天狼星紅(PSR)染色，顯微鏡下觀察心肌細胞橫截面積和心肌纖維化的變化。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 Smyd2基因敲除小鼠的鑒定

Smyd2基因敲除小鼠采用CRISPR-Cas9技術，在Smyd2基因組DNA的第二個外顯子兩端分別設計2個sgRNA，以切割刪除包含第二個外顯子的部分，構建示意圖見圖1A?；蚓庉嬓∈蟪晒嫿ê?，取鼠尾組織基因組進行鑒定，鑒定結果如下圖：WT小鼠鑒定的PCR產物大小為2 096 bp，刪除掉Smyd2的第二個外顯子后，Smyd2-KO鑒定的PCR產物為1 411 bp(圖1B)。證明成功構建Smyd2敲除的純合子小鼠。

注：A.C57/6J小鼠Smyd2基因示意圖，sgRNA靶位點用紅色箭頭表示。F1：PCR鑒定正向引物，R1：PCR鑒定反向引物。B.小鼠鼠尾鑒定 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。WT：wild-type C57小鼠，Smyd2-KO：Smyd2基因敲除小鼠。

2.2 Smyd2基因敲除對心臟功能的影響

為了明確Smyd2在壓力超負荷誘導的心肌肥厚中的作用，本研究檢測了Smyd2基因敲除對心臟功能的影響。超聲結果表明，TAC手術4周后，Smyd-KO組的左室舒張末期內徑和左室收縮末期內徑均顯著高于WT組，而射血分數和短軸縮短率顯著低于WT組(P<0.05)(表1)。表明Smyd2基因敲除促進了壓力負荷導致的心臟功能受損。

表1 TAC手術4周后各組超聲檢測結果的比較

2.3 Smyd2基因敲除對心肌肥厚的影響

HE染色結果顯示，TAC手術4周后，Smyd2-KO組小鼠較WT組心臟體積明顯增大(圖2)，定量統計結果顯示Smyd2-KO組心肌細胞面積(503.77±24.78)較WT組(334.91±22.37)顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。表明Smyd2基因敲除顯著加重了壓力負荷導致的心肌肥厚。

圖2 TAC手術4周后各組小鼠心臟組織HE染色

2.4 Smyd2基因敲除對心臟纖維化的影響

PSR染色結果顯示，TAC手術4周后，與WT組相比較，KO組心臟纖維化程度明顯加重(圖3)。統計學分析表明，KO組心肌膠原纖維含量(3.63±1.25)%較WT組(1.40±0.34)%明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明，Smyd2基因敲除顯著加重了壓力負荷導致的心臟纖維化。

圖3 TAC手術4周后各組小鼠心臟組織PSR染色的代表性圖片

3 討論

心肌肥厚是心臟對各種生理刺激和病理損傷導致的血流動力學負荷增大的代償性應答，其主要特征為心臟重量增大，心肌細胞肥大，蛋白質合成增多[1]。代償期心肌肥厚表現出適應性的心臟收縮能力增強，心臟輸出量維持正常。但是，長期的持續性的心肌肥厚常會進展為心力衰竭，并且最終導致心血管相關病死率顯著增加[15]。此外，抑制心肌肥厚的病理進展能有效降低心力衰竭發病率和死亡率[16]。因此，迫切需要更多研究深入了解心肌肥厚促發機制以及抗肥厚的保護性分子。以期未來能夠開發特異性的分子有效抑制心肌肥厚的疾病進展。

本研究選用Smyd2-KO小鼠為研究對象，通過主動脈弓縮窄術建立心肌肥厚模型，術后4周分別通過超聲檢測心臟功能、組織病理學檢測心肌肥厚和纖維化，全面評估了Smyd2敲除對壓力超負荷誘導的病理性心肌肥厚的影響。結果顯示Smyd2敲除后，壓力負荷導致的心臟功能受損明顯加重，并且病理學評價顯示，Smyd2敲除顯著加重了壓力負荷誘導的心肌肥厚和心臟纖維化。這些結果一致表明，Smyd2敲除促進了病理性心肌肥厚和心臟重構的發生發展。此前的研究表明，Smyd2在心臟和腦組織中具有較高的表達豐度，并且Smyd2在心臟發育過程中差異表達[11]。然而，有研究表明，Smyd2的心臟特異性敲除并不會影響心臟的正常發育以及功能，但是能夠有效調控翻譯相關的基因轉錄[17]。這提示Smyd2并不影響正常心臟生理過程，而可能在多種心臟病理應激過程中發揮作用，如心肌梗死、心肌缺血、心肌肥厚等。本研究證實了敲除Smyd2不影響生理條件下的心臟功能，而加重了肥厚心臟的心臟功能受損。這提示Smyd2有潛力成為一個病理性心肌肥厚中有效的治療靶標。

在正常水平以及壓力負荷水平下，心肌細胞的功能維持需要一個復雜的調控網絡控制基因表達。壓力的不同類型和持續時間會導致這個調控網絡發生改變，進而影響心臟表型改變，最終導致心力衰竭[18]。Smyd2作為一個研究廣泛的甲基轉移酶，能夠有效調控細胞內的基因轉錄及翻譯過程[6]。Smyd2在心臟功能維持以及心肌肥厚中的轉錄調控作用目前還不夠清楚。本研究觀察到Smyd2基因敲除促進心肌肥厚的疾病進展，但是并未深入探討Smyd2的轉錄調控機制，后續需進一步深入探究Smyd2在心肌肥厚中的具體機制。