軟飲料對小鼠增重、血清生化指標和組織細胞的影響*

曹瑩琪 江曉晗 曾 歡 劉曉婷 周向梅 袁建敏

(1.中國農業大學動物醫學院，北京 100193)(2.中國農業大學動物科技學院，北京 100193)

軟飲料的消費已成為一個高度可見和有爭議的公共衛生和公共政策問題。數據顯示我國成人居民來自含糖飲料的添加糖攝入量平均每人每日為13.4 g，且總體消費率呈上升趨勢[1]。軟飲料被許多人認為是肥胖癥和相關健康問題的主要貢獻者，而關于軟飲料對機體生長發育、組織臟器等方面的研究較少。本研究選擇市場上常見的四種軟飲料——美年達、可樂、綠茶飲料、咖啡飲料，給小鼠飲用2個月，觀察小鼠增重、血清生化指標、器官系數以及組織細胞損傷等，進行綜合比較和分析，以期為人們科學合理地飲用軟飲料提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

選用斷乳SPF 級KM小鼠80只，雌雄各40只，雄鼠體質量12.2～15.0 g，雌鼠體質量7.8～9.5 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物的生產許可證號【SCXK(京)2016-0006】。動物實驗在中國農業大學實驗動物房進行，實驗動物使用許可證號【SYXK(京)2020-0037】，所有實驗均獲得中國農業大學動物醫學院實驗動物倫理委員會的批準與監督【IACUC號：AW02010202-2】。實驗者嚴格遵循國際實驗動物福利倫理“3R”原則，給予小鼠應有的人道關懷。小鼠飼養于清潔級實驗動物房，環境溫度(24.72±1.90)℃，環境相對濕度64.40%±17.59%。

1.2 實驗飼料

由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供的SPF級小鼠飼料以及墊料；實驗飲料為美年達、百事可樂、統一綠茶和三得利利趣拿鐵，均為合格市售品牌，且均在保質期內；對照組飲用煮沸后自然冷卻的北京市自來水。

1.3 儀器設備

全自動生化儀(型號：日立7600，日立集團)，放免儀(型號：xh6080，西安核儀廠)，電子天平(型號：JM1102-JM1003，上海紀銘)，冷凍型高速臺式離心機(型號：SORVALL Stratos，Thermo)。生化指標由北京萊雅生物科技有限公司分析檢測完成。

2 方法

2.1 實驗分組

將80只小鼠隨機分為5個處理組，分別是美年達組、可樂組、綠茶組、咖啡組和白開水組，每組8只雌鼠和8只雄鼠，雌雄分籠飼養。整個實驗過程中, 每組小鼠均飼以相同飼料，自由進食, 并飲用相應的飲料。實驗期間，每10 d測1次體質量和采食量。

2.2 樣本采集和處理

實驗第66天，每個處理組分別取5只雄鼠和5只雌鼠。采用摘眼球采血法取得血液樣品，分離血清樣本，檢測生化指標。安樂死小鼠后分離雙側股骨、心臟、肝、脾、肺、腎，并用電子稱精確稱重，計算臟器系數。每組隨機取3只雄鼠和3只雌鼠的肝、腎組織，制作病理切片。

2.3 血液生化指標的測定

由北京萊雅生物科技有限公司檢測鈣、血糖(blood glucose,GLU)、三酰甘油(triglyceride,TG)、尿素氮(UREA/blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,CRE)、白蛋白(albumin,ALB)、總蛋白(total protein,TP)水平，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、天門冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase, AST)活力。

2.4 小鼠肝和腎病理切片

將肝與腎組織固定于4%多聚甲醛中，進行常規石蠟包埋、切片、HE染色并觀察。

2.5 統計學分析

3 結果

3.1 不同類型飲料對小鼠增重及日均采食量的影響

由圖1可知，實驗第10天，與白開水組相比雄鼠飲用美年達、可樂、綠茶和咖啡后的體質量均顯著增加(P<0.05)；實驗第20天，雄鼠飲用美年達、可樂、綠茶后的體質量均顯著高于咖啡組和白開水組(P<0.05)；在實驗第30～66天時，同時期的各飲料組的雄鼠體質量較對照組減少，但無統計學差異(P>0.05)。由圖2可知，各時段不同飲料處理組的雄鼠日采食量少于白開水組。

圖1 不同組別雄鼠的體質量變化

圖2 不同組別雄鼠的日均采食量

由圖3可知，實驗第10天，雌鼠飲用美年達、綠茶、咖啡后的體質量均顯著高于白開水組(P<0.05)；實驗第20、30天，與白開水組相比，雌鼠飲用4種軟飲料后的體質量均顯著增加(P<0.05)；在實驗第40、50、60天，同時期的處理組間無顯著性差異(P>0.05)；實驗第66天，雌鼠飲用美年達、咖啡后，體質量顯著高于白開水組(P<0.05)。在整個實驗階段，飲用各種飲料的雌鼠體質量均有所升高。由圖4可知，咖啡組的雌鼠采食量在實驗后期高于其他組，美年達組在各期均低于其他組。

圖3 不同組別雌鼠的體質量變化

圖4 不同組別雌鼠的日均采食量

3.2 不同類型飲料對小鼠臟器系數的影響

由表1，2可知，除脾系數(P<0.05)和肺系數(P<0.05)外，不同類型飲料對雌雄小鼠的心臟系數、肝系數、肺系數、腎系數和肱骨系數無顯著影響(P>0.05)。

表1 不同組別雄鼠的內臟器官指數(%)

表2 不同組別雌鼠的內臟器官指數(%)

3.3 不同類型飲料對小鼠血液生化指標的影響

由表3可知，雄鼠飲用美年達、可樂后的尿素氮水平顯著低于其余處理組(P<0.05)；飲用綠茶的雄鼠三酰甘油含量顯著高于白開水對照組(P<0.05)；雄鼠飲用該4種不同的飲料后，其總蛋白含量均高于白開水對照組，但除綠茶組外其余處理組均無統計學意義(P>0.05)。血糖、肌酐、白蛋白等指標在各處理組間均無統計學差異(P>0.05)。

表3 不同組別雄鼠的生化指標

由表4可知，不同類型飲料對雌鼠的生化指標影響比對雄鼠的影響更為明顯。雌鼠飲用該4種軟飲料后，其尿素氮水平均顯著低于白開水對照組(P<0.05)。雌鼠飲用美年達和綠茶后的肌酐水平顯著低于白開水對照組(P<0.05)。4個處理組的堿性磷酸酶、谷草轉氨酶的含量均低于白開水組，其三酰甘油含量均高于白開水組。

表4 不同組別雌鼠的生化指標

3.4 不同類型飲料對小鼠肝、腎組織結構的影響

美年達和可樂組的肝損傷程度最高，綠茶和咖啡組損傷程度較輕。由圖5中可看出，白開水組小鼠肝小葉結構清晰，肝索排列整齊，肝竇清晰，肝細胞形態大小正常，細胞質均勻，細胞核明顯，且無變性壞死，肝細胞內未出現脂滴。而美年達和綠茶組的肝小葉結構不清晰，肝索排列紊亂，肝細胞腫脹，界限不清，胞質里有紅染顆粒，即出現了一定程度的顆粒變性?？蓸方M肝細胞中可見細胞腫脹，胞質疏松，胞質淡染或呈大小不一的空泡，且出現了炎性細胞浸潤?？Х冉M肝細胞界限不清，胞質內有紅染顆粒，顆粒變性較為嚴重。

注：A.細胞腫大，胞質出現空泡；B.炎性細胞浸潤；C.細胞腫大，胞質出現空泡；D.細胞內的紅染顆粒，細胞界限不清；E.肝正常。F、G、H出現蛋白管型，I、J為正常腎。

白開水組小鼠的腎組織結構正常，腎小管形態正常，各結構間界限清晰。美年達、可樂、綠茶組腎小管內可見蛋白管型，咖啡組腎組織正常。

以上結果說明軟飲料可引起機體的物質代謝障礙，對組織細胞造成損傷。

4 討論

在實驗前期，飲用美年達、綠茶和可樂的雄鼠體質量均顯著高于白開水組，實驗后期則明顯降低。而飲用咖啡的雄鼠體質量在整個實驗過程中大多高于白開水組。相比于雄鼠，軟飲料對雌鼠的增重影響更為明顯，在整個實驗過程中，飲用4種飲料的雌鼠體質量均高于白開水組。這是因為這4種飲料中均含有較高的糖分，增加了攝入的能量，雖然實驗早期小鼠通過減少食物攝入來維持攝入總能量的平衡[2]，但總體上能量攝入仍過多，故體質量均明顯增加[3-4]。但長期飲用含糖飲料會抑制小鼠食欲，導致其進食減少，營養不均衡[5]，因此雄鼠體質量在實驗后期下降，但由于對雌鼠的食欲抑制較不明顯，故雌鼠體質量并沒有下降。相比于其他飲料，咖啡對雌雄鼠的食欲抑制較小，原因可能是咖啡因可興奮中樞神經系統的迷走中樞，刺激迷走神經胃支，從而引起胃泌酸增加和胃腺分泌亢進[6]。

臟器系數的變化通?？梢暂^好地反映受試物對實驗動物臟器的影響或者初步的毒性判斷。本次研究中，各處理組心臟、肝、腎、肱骨的臟器系數和白開水組無顯著差異，與參考文獻[7]的研究相符。由此看出，該4種飲料對小鼠的心臟、肝、腎和肱骨的發育無急性毒性損傷作用。

在血清生化指標方面，本實驗中小鼠飲用軟飲料后總蛋白含量顯著升高。血清總蛋白主要反映肝在蛋白質代謝方面的功能、慢性肝損傷及其病情程度以及肝實質細胞的儲備功能[8]。本實驗中總蛋白升高的原因可能是軟飲料中含有較多的糖類、色素等物質，使機體血液滲透壓升高，進而導致脫水所致。尿素氮是動物蛋白質在肝代謝后的最終產物，血清尿素氮和肌酐含量可反映動物肝、腎的損傷程度。本實驗中，小鼠飲用軟飲料后的尿素氮、肌酐含量均降低，無臨床診斷意義，說明軟飲料對小鼠的損傷并不顯著。大量果糖攝入可快速刺激脂肪生成和三酰甘油的積累[9]，本實驗中雌鼠飲用4種飲料后，血清三酰甘油均增加，這可能會增加患冠心病的危險性，而且三酰甘油過高還會引起脂肪肝、糖尿病、慢性腎炎等疾病[8]。在血糖指標上，本實驗與參考文獻[7]的研究相符，飲用軟飲料并未造成血糖含量的顯著變化。

軟飲料中含有高果糖玉米糖漿，果糖轉化成的脂肪在肝中積累可導致非酒精性脂肪肝疾病。此外可樂中含有的焦糖色素富含高級糖基化終產物，也可能增加胰島素抵抗和產生炎性反應。胰島素抵抗和氧化應激增加了游離脂肪酸向肝的輸送，肝三酰甘油酯積累的增加也導致了脂肪肝[10]。果糖過多導致大鼠肝組織脂質過氧化和脂肪變性，脂質過氧化可能在果糖誘導的肝細胞損傷中起作用[11]。這與本實驗碳酸飲料組導致肝組織變性、炎性細胞浸潤結果一致。有研究[12-13]發現長期飲用碳酸飲料會對腎的組織產生不利影響，出現明顯的蛋白尿，腎小管中出現透明管型等，且飲用富含果糖的飲料后可觀察到更大的腎氧化應激和輕度腎損傷(腎小球和腎小管改變)[14]，這與本研究中腎出現蛋白管型的結果一致。而未見咖啡和綠茶對肝損傷的相關報道，實驗結果出現了輕度損傷的可能原因是咖啡和茶飲料當中含有較多的糖分。

值得關注的是，長期飲用上述4種軟飲料對雌鼠的影響比對雄鼠的影響更為明顯，推測其可能與性激素影響某些代謝酶的活性有關，有研究表明，雄性激素能夠促進細胞色素P-450的活性，而雌性激素可以抑制肝微粒體的氧化過程，所以一些化學物對雌性動物的不良影響顯著大于對雄性動物的不良影響[15]。

綜上所述，本實驗表明長期飲用軟飲料對小鼠的生長發育存在不良影響，促進小鼠早期增重過快并促進脂肪的合成，同時也會使肝、腎組織出現一定程度的病理變化。