SIRT3多酚激活劑的抗細胞氧化應激作用及機制

陳 慧，彭雨欣，徐瑩皓，趙 沖

（中國農業大學食品科學與營養工程學院 北京 100083）

多酚是植物性食物中廣泛存在的一種非營養成分，根據其化學結構特點主要分為酚酸、類黃酮、芪類、香豆素、單寧等，具有豐富的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗衰老、抗動脈粥樣硬化、抗代謝性疾病、抗菌和光損傷保護作用等，在促進人體健康、美容護膚等方面發揮重要作用[1-3]。日常膳食中多酚的主要來源包括水果、蔬菜、全谷物、香草、香料、咖啡豆和茶葉等[4]。本課題組前期研究發現部分多酚類化合物可直接作用于Caco-2 或HaCaT細胞，促進SIRT3 的轉錄表達，上調抗氧化酶SOD2 的活性，從而增強細胞的抗氧化能力，緩解細胞的氧化應激損傷[5-6]。近年來，臨床發現皮膚與腸道之間具有密切的關系。腸道吸收異常會引發皮膚病，如腸病性肢端皮炎、皮膚過敏、銀屑病等，而患有這些皮膚病的同時，腸道也會表現出腹脹、腹瀉、大便粘稠等癥狀[7-8]。多酚類化合物經腸道吸收后，是否還能發揮保護作用需要進一步探究。

Caco-2 細胞來源于人結腸腺腫瘤，可在體外培養條件下自發分化形成連續單層的腸上皮樣細胞，與腸道上皮細胞在形態學和生理功能上具有相似性[9-10]。由于Caco-2 單層細胞模型簡便、高效的特點，國內外通常將其作為體外模擬腸道吸收模型，應用于大量口服藥物的篩選以及藥物的轉運吸收研究中[11-12]。近年來在食品領域，特別是膳食活性成分的功能研究領域也開始運用Caco-2單層細胞模型預測活性成分在體內的吸收情況，如利用Caco-2 單層細胞模型檢測類胡蘿卜素類化合物的運輸效率，發現蝦青素的運輸效率最高[13]；利用Caco-2 細胞單層模型評價藍莓花色苷類化合物的吸收情況，可以得到花色苷在Caco-2 細胞單層的吸收規律，即羥基基團越多，-OCH3基團越少，其滲透性越差[14]。通過對膳食活性成分在Caco-2 單層細胞模型吸收、轉運情況的探究，篩選高效的目標活性物質。此外，將膳食活性成分處理Caco-2 單層細胞后與靶細胞共培養，則能直觀反映活性成分在腸道吸收后對靶器官或組織的影響。

前期研究表明，白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮4 種多酚均能促進HaCaT 細胞SIRT3基因的表達，是潛在的SIRT3 多酚激活劑，其中白藜蘆醇、安石榴苷、漆樹黃酮降低了UVB 誘導的HaCaT 細胞內ROS 水平，安石榴苷對UVB 引起的細胞衰老具有修復作用[6]。這些多酚類化合物對HaCaT 細胞的保護作用極有可能與SIRT3 介導的抗氧化途徑有關。在此基礎上，本文進一步探究這4 種多酚類化合物以及月見草素B 在被腸道轉運后的保護作用及機制。通過建立Caco-2 與HaCaT細胞trans-well 共培養體系，體外模擬腸道轉運吸收，從以下兩個方面探究白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮以及月見草素B 這5 種多酚類化合物的保護作用：一是多酚對HaCaT 細胞SIRT3的間接激活作用，二是多酚對UVB 誘導的HaCaT細胞氧化應激的間接抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮和月見草素B 的來源見表1，化學結構參照Ito 等[15]的研究結果。

表1 多酚類化合物Table 1 Polyphenols

人結直腸腺癌細胞（Caco-2）、人正常皮膚永生化角質形成細胞（HaCaT），日本理研生物資源中心（筑波，日本）；4 孔板細胞培養皿、0.4 μm 高密度半透明PET 膜，美國Corning 公司；DMEM 培養基，日本Nissui 公司；0.25%胰蛋白酶消化液、胎牛血清，美國Life Technologies 公司；總RNA 提取試劑盒，日本Roche 公司；pEGFP-C3 熒光蛋白報告系統，日本Takara 公司；慢病毒表達質粒pSUPER.retro.puro，美國OligoEngine 公司；HilyMax 轉染試劑，日本Dojindo 公司；聚凝胺，美國Merck Millipore 公司；Thunderbird SYBR qPCR Mix 熒光定量PCR 試劑盒，日本Tiyobo 公司；BESH2O2-Ac 過氧化氫熒光探針，日本WAKO 公司。

1.2 儀器與設備

CO2培養箱，美國Thermo 公司；細胞電阻儀Millicell-ERS-2，美國Millipore 公司；Thermal Cycler Dice Real Time System TP-800 實時熒光定量PCR 儀，日本Takara 公司；IN Cell Analyzer 1000，英國GE Healthcare 公司；CL-1000 紫外交聯儀，美國UVP 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Caco-2 細胞的分化 Caco-2 細胞，采用含10%胎牛血清的DMEM 培養基，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。選取培養至3～6 代的處于對數生長期的Caco-2 細胞，接種于細胞培養小室的PET 膜上（AP 側，Apical side），密度為2×105/mL，體積250 μL，在小室的下側（BL 側，Basolateral side）加入750 μL DMEM 完全培養基。每3 d 更換一次培養基，進行Caco-2 細胞的自發分化?？瞻讓φ战M中AP 側和BL 側中加入對應等量的DMEM 完全培養基。

1.3.2 單層Caco-2 細胞跨膜電阻值（TEER）的測定 Caco-2 細胞自發分化后會形成連續的單層細胞。采用細胞電阻儀測定單層Caco-2 細胞的TEER 值。首先將電極放入預熱至37 ℃的Hank's平衡鹽溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）中平衡20 min。吸走AP 側和BL 側的培養基，在AP 側和BL 側分別加入500 μL 和1.5 mL 的HBSS 洗滌，重復2 次。吸走HBSS 后，在AP 側和BL側分別加入500 μL 和1.5 mL 的HBSS，檢測單層細胞兩側的跨膜電阻?？瞻讓φ战M也按照以上操作，獲得空白值。TEER 值（Ω·cm2）=（測定電阻值-空白值）/單層表面積。試驗重復3 次。通過測定Caco-2 細胞的TEER 值，可以判斷Caco-2 細胞是否形成緊密連續的單層細胞。

1.3.3 Caco-2 細胞與HaCaT 細胞trans-well 共培養體系的建立 HaCaT 細胞，采用含10%胎牛血清的DMEM 培養基，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。將處于對數生長期的HaCaT 細胞接種于24 孔板，每孔細胞數量為1×105，待細胞完全貼壁后，將接種有自發分化形成緊密連續的單層Caco-2 細胞的小室，置于接種有HaCaT 細胞的24 孔板上，即形成Caco-2 細胞與HaCaT 細胞trans-well 共培養體系，AP 側為Caco-2 細胞，BL側為HaCaT 細胞。在共培養體系的AP 側分別加入終濃度為10 μmol/L 的白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮、月見草素B，對照組中加入等量的DMSO。整個共培養體系在37 ℃、5%CO2的條件下繼續培養48 h，用于下一步試驗。

1.3.4 構建HaCaT 細胞SIRT3-EGFP 報告基因系統 HaCaT 細胞SIRT3-EGFP 報告基因系統的構建參考Zhao 等[5]的方法。以人類基因組DNA 為模板，進行PCR 擴增人類SIRT3 啟動子（-653--1），將其裝入無啟動子的pEGFP-C3 表達載體中，得到特定的pSIRT3p-EGFP 質粒。將構建的pSIRT3p-EGFP 質粒轉染HaCaT 細胞，用于評價受試物對SIRT3 啟動子活性的影響。利用IN Cell Analyzer 1000 監測EGFP 熒光的變化，可定量測定SIRT3 啟動子的活性。SIRT3 激活劑篩選系統如文獻[6]中的圖1所示。試驗重復3 次。

1.3.5 HaCaT 細胞SIRT3 基因表達水平的測定 按照總RNA 提取試劑盒說明提取細胞RNA，參照Fujiki 等[16]的方法反轉錄合成cDNA。以cDNA 為模板，根據Thunderbird SYBR qPCR Mix試劑盒說明進行半定量實時熒光定量聚合酶鏈式反應 （Quantitative real-time PCR，qRT-PCR），測定細胞SIRT3 基因mRNA 表達水平。β-actin 為內參基因。SIRT3 和β-actin 基因的PCR 引物序列見表2。試驗重復3 次。

1.3.6 評價SIRT3 多酚激活劑對UVB 誘導Ha-CaT 細胞產生ROS 的清除作用 Caco-2 細胞培養14 d 后，自發分化形成緊密連續的單層細胞，可以用于下一步試驗。第15 天將需要評價的受試物加入含有Caco-2 細胞的AP 側，培養48 h 后收集BL 側的培養液，并于-80 ℃保存以備用。

將處于對數生長期的HaCaT 細胞接種于10 mm 細胞培養皿中，每孔的細胞數量為5×105。培養24 h 后，吸出培養基，加入少量磷酸緩沖鹽溶液（PBS）覆蓋細胞，利用紫外交聯儀對細胞進行紫外線處理，照射劑量為8 mJ/cm2。24 h 后，使用0.25%胰蛋白酶消化液消化HaCaT 細胞，將其重新接種于96 孔板，培養6 h 后，吸走培養基，加入之前回收的已解凍預熱的Caco-2 細胞培養體系中BL 側的培養液，培養48 h 后測定HaCaT 細胞內活性氧含量。試驗重復3 次。

1.3.7 HaCaT 細胞內活性氧含量的測定 采用過氧化氫特異性熒光探針BES-H2O2-Ac 法測定細胞內活性氧分子 （Reactive oxygen species，ROS）的含量。吸出培養基，用4-羥乙基哌嗪乙磺酸【4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES，pH=7.4】緩沖液洗滌細胞2 次，然后加入終濃度為5 μmol/L 的BES-H2O2-Ac 和Hoechst 33342 染料，37 ℃培養箱內孵育30 min。消化并收集細胞，HEPES 潤洗2 次后用顯微細胞圖像分析測定系統IN Cell Analyzer 1000 進行檢測。

1.3.8 shSIRT3-HaCaT 細胞模型的構建 shSIRT3-HaCaT 細胞模型按照先前建立的方法[17]構建。設計靶向SIRT3 基因特異性短發夾RNA（shRNA）表達的引物序列 （表2） 并連接到慢病毒表達質粒pSUPER.retro.puro 中，成功構建慢病毒重組表達質粒pSUPER-puro-shSIRT3。使用HilyMax 轉染試劑將pGag-pol，pVSV-G 質粒以及構建的重組表達質粒pSUPER-puro-shSIRT3 共轉染293T 細胞后，細胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h 之后，棄去舊培養基，用含2%胎牛血清的DMEM 培養基繼續培養24 h。收集病毒上清液，并添加10 mg/mL 聚凝胺，用于感染HaCaT 細胞。24 h 后，在HaCaT 細胞中添加3 μg/mL 嘌呤霉素，處理3 d，篩選得到pSUPER-puro-shSIRT3 穩轉HaCaT 細胞系。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.4 數據統計分析

試驗數據采用軟件SPSS 19.0 進行統計學分析，組間比較采用單因素ANOVA 方差分析，Turkey 法進行事后檢驗，結果以“平均數±標準差”表示，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單層Caco-2 細胞跨膜電阻值的測定結果

Caco-2 細胞可在體外培養條件下自發進行上皮樣分化，并且形成緊密連接的單層。TEER 值用于評價單層Caco-2 細胞是否形成了致密的緊密連接。本試驗分別測定了Caco-2 細胞在體外培養3 d 及14 d 時的TEER 值，結果如圖1所示。Caco-2 細胞在體外培養14 d 時，TEER 值顯著高于培養3 d 時細胞的TEER 值，且其遠遠大于500 Ω·cm2，表明單層Caco-2 細胞具有足夠的緊密連接和完整性[18-19]。因此，選擇在Caco-2 細胞培養14 d 時，建立Caco-2 和HaCaT 細胞共培養體系。

圖1 培養時間對Caco-2 細胞跨膜電阻值的影響Fig.1 Effects of culture time on trans-epithelial resistance of Caco-2 cells

2.2 多酚類化合物對HaCaT 細胞SIRT3 表達的影響

構建HaCaT 細胞SIRT3-EGFP 報告基因系統，在Caco-2 和HaCaT 細胞共培養體系（圖2）中分別評價了白藜蘆醇（Resveratrol，RSV）、山奈酚（Kaempferol）、安石榴苷（Punicalagin）、漆樹黃酮（Fisetin）、月見草素B（Oenothein B）這5 種多酚類化合物在干預Caco-2 細胞后，對HaCaT 細胞SIRT3 表達的影響，結果如圖3、圖4所示。利用IN Cell Analyzer 1000 對細胞內EGFP 熒光定量分析結果顯示，在多酚類化合物的干預下，HaCaT細胞內EGFP 熒光強度相比于對照組 （DMSO）均顯著增強。利用qRT-PCR 技術進一步檢測HaCaT細胞內源性SIRT3 基因mRNA 表達水平的結果顯示，白藜蘆醇、山奈酚、月見草素B 顯著上調了該基因的表達水平，而安石榴苷與漆樹黃酮沒有顯著影響。上述研究結果表明，白藜蘆醇、山奈酚、月見草素B 可以間接增強HaCaT 細胞SIRT3 基因的表達。

圖2 Caco-2 與HaCaT 細胞trans-well 共培養體系Fig.2 Trans-well co-culture system of Caco-2 and HaCaT cells

圖3 多酚類化合物對EGFP 熒光強度的影響Fig.3 Effects of polyphenols on EGFP fluorescence intensity

圖4 多酚類化合物對SIRT3 mRNA 表達水平的影響Fig.4 Effects of polyphenols on SIRT3 mRNA expression

2.3 SIRT3 多酚激活劑對UVB 誘導HaCaT 細胞產生ROS 的清除作用

在共培養體系中，本文進一步評價了能夠激活SIRT3 表達的3 種多酚類化合物對UVB 誘導的HaCaT 細胞內ROS 的清除作用。如圖5所示，在UVB 照射條件下，HaCaT 細胞內ROS 的含量顯著增加（P＜0.01），提示HaCaT 細胞在UVB 照射下發生了氧化應激；白藜蘆醇、山奈酚、月見草素B 在Non-UVB 條件下對細胞內ROS 的產生沒有顯著影響；而在UVB 照射條件下，月見草素B 極顯著地降低了HaCaT 細胞內ROS 水平；白藜蘆醇和山奈酚并未顯著清除UVB 誘導的過量ROS 的產生。綜上所述，在Caco-2 和HaCaT 細胞共培養體系下，月見草素B 具有降低UVB 誘導的HaCaT細胞氧化應激的作用。

圖5 具有激活SIRT3 轉錄作用的多酚類化合物對Non-UVB 及UVB 照射下細胞內ROS 含量的影響Fig.5 Effects of polyphenols with SIRT3 activation activity on intracellular ROS levels induced by Non-UVB exposure and UVB exposure

2.4 SIRT3 介導月見草素B 調控HaCaT 細胞氧化應激水平

為了進一步驗證月見草素B 清除HaCaT 細胞中UVB 誘導的ROS 是否依賴于SIRT3，本試驗按照1.3.8 節的方法建立了HaCaT 細胞SIRT3 基因沉默模型，并按照1.3.6 節的方法評價了月見草素B 對Mock-HaCaT 細胞以及shSIRT3-HaCaT細胞中UVB 誘導產生的ROS 的清除作用。結果如圖6所示。在Mock-HaCaT 細胞中，月見草素B對UVB 誘導的ROS 具有顯著的清除作用，ROS水平比DMSO 處理組降低了14%；當SIRT3 基因沉默后，月見草素B 不再有效地抑制ROS 的產生。由此可見，月見草素B 對細胞內ROS 的清除作用具有SIRT3 依賴性。

圖6 月見草素B 對UVB 照射條件下的Mock 和SIRT3 基因沉默（shSIRT3）HaCaT 細胞內ROS 水平的影響Fig.6 Effects of oenothein B on intracellular ROS levels in UVB-irradiated Mock-and SIRT3-silenced （shSIRT3） HaCaT cells

3 討論

本文構建了HaCaT 細胞SIRT3-EGFP 報告基因系統，在Caco-2 細胞及HaCaT 細胞共培養體系中，評價了白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮、月見草素B 這5 種多酚類化合物在腸道吸收后對HaCaT 細胞SIRT3 表達的影響，以及對UVB誘導的HaCaT 細胞氧化應激的抑制作用。研究發現，在Caco-2 與HaCaT 細胞共培養體系下，月見草素B 降低了HaCaT 細胞氧化應激水平，SIRT3介導了其對ROS 的調控。

在前期研究發現白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮均能夠在激活HaCaT 細胞中SIRT3的表達。為了進一步探究幾種多酚化合物在經過腸道吸收后，對HaCaT 細胞的影響，構建了Caco-2 與HaCaT 細胞共培養體系。結果表明，白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮以及月見草素B均能顯著增強HaCaT 細胞外源性SIRT3 的表達。內源性SIRT3 mRNA 表達結果表明，安石榴苷在共培養體系下并不能激活HaCaT 細胞的SIRT3基因的轉錄表達。前期研究發現，當安石榴苷作用于單獨培養的HaCaT 細胞時，它可以顯著激活HaCaT 細胞SIRT3 基因的表達[6]；當它作用于單獨培養的Caco-2 細胞時，并沒有影響其SIRT3 基因的轉錄活性[5]。P-糖蛋白是一種跨膜轉運糖蛋白，主要分布于細胞質膜上，是主要的外排轉運蛋白，也是耐藥形成的重要因素[20-21]。多項研究報道安石榴苷是P-糖蛋白的底物，P-糖蛋白參與了安石榴苷的轉運過程[22-24]。由此推測，上述原因可能導致了Caco-2 細胞對安石榴苷的吸收率低下，進一步影響HaCaT 細胞中SIRT3 的表達。白藜蘆醇、山奈酚、漆樹黃酮作用于單獨培養的Caco-2 細胞與HaCaT 細胞均能顯著增強兩種細胞SIRT3 的表達[5-6]，然而在共培養體系下，白藜蘆醇和山奈酚表現出顯著的SIRT3 激活作用，漆樹黃酮并未激活SIRT3 的表達。漆樹黃酮與山奈酚均屬于黃酮醇類化合物，也是同分異構體，二者的差別在于山奈酚的A 環C5 位上多了一個羥基，而漆樹黃酮的B環C5' 位上多了一個羥基。結構差異可能導致其滲透性以及通過細胞單層所需要的共軛結合力的差異，從而導致漆樹黃酮的作用效果不顯著，而山奈酚卻具有良好的效果[25-26]。

綜合上述結果可知，本文共篩選得到3 種多酚（白藜蘆醇、山奈酚以及月見草素B），可增強共培養體系下HaCaT 細胞的SIRT3 基因表達。SIRT3 是去乙?；福⊿irtuin）家族中的一員，主要位于線粒體中，可以發揮去乙?；钚?，調節線粒體的功能、再生和動態，從而維持氧化還原穩態，以防止細胞代謝過程中發生的氧化應激[27-28]。在共培養體系中，通過UVB 誘導HaCaT 細胞發生氧化應激，評價了白藜蘆醇、山奈酚、月見草素B 對活性氧的清除作用。試驗數據表明，月見草素B 顯著減少了細胞內ROS 水平。為了進一步驗證SIRT3 在月見草素B 改善UVB 誘導的細胞氧化應激中的必要性，本文構建了SIRT3 基因沉默的HaCaT 細胞，結果表明SIRT3 基因表達的沉默顯著抑制了月見草素B 對ROS 的清除能力。研究表明，桉葉水提物可顯著減少抑制f-MLP（Formylmet-leuphenylalanine）和PMA（4β-phorbol-12βmyristate-α13-acetate） 誘導的人中性粒細胞活性氧的產生，而且很大程度上歸因于桉葉水提物中含有的月見草素B[29]。Chen 等[30]發現月見草素B可減少線蟲衰老過程中ROS 的累積，并延長其壽命，其主要的作用靶點包括insulin/IGF-1、飲食限制以及線粒體電子傳遞鏈等途徑上的關鍵基因。月見草素是一種潛在的高效抗氧化劑，并有助于延緩衰老。本研究發現月見草素B 對UVB 誘導的細胞活性氧也有很好的清除效果，并且為月見草素B 的抗氧化機制提供了新的思路。

綜上所述，本文首次發現了月見草素B 在Caco-2 與HaCaT 細胞共培養體系中，增強HaCaT細胞SIRT3 基因的表達，并抑制UVB 引起的Ha-CaT 細胞的氧化應激水平，其抗氧化作用具有SIRT3 依賴性。月見草素B 在單獨培養的Caco-2細胞中并沒有影響其SIRT3 基因的表達[5]。因此，月見草素B 是通過Caco-2 細胞的吸收、轉運后，以原型的方式作用于HaCaT 細胞，還是通過Caco-2 細胞的代謝作用產生的活性物質作用于HaCaT 細胞，尚有待研究。今后可進一步探究月見草素B 在Caco-2 細胞單層模型中的攝取特性、轉運機制以及代謝產物的組成。再者，體外模擬腸道吸收的條件與實際情況還存在偏差，因此月見草素B 的體內藥動學研究對于優化其生物利用度、發揮其最佳的功效具有重要意義。此外，月見草素B 可能通過影響Caco-2 細胞自身分泌物的改變，而間接影響HaCaT 細胞。研究表明，肌肽是一種SIRT3 的激活劑，可促進Caco-2 細胞分泌可激活神經元SH-SY5Y 細胞的外泌體，并促進外泌體中一種新型miRNA-miR-6769-5p 的表達，從而增強了其靶基因ATXN1 的表達，激活SH-SY5Y 細胞[31]。多項研究發現靶向調節SIRT3 的miRNA 有很 多，如miRNA-31、miRNA-1、miRNA-19b 和miRNA-320 等[32-33]。因此，從miRNA 層面深入探究在Caco-2 與HaCaT 細胞共培養體系下，月見草素B 依賴SIRT3 發揮抗氧化作用的分子機制是個潛在的研究方向。本文的研究為月見草B 作為食品功能因子的開發提供了理論依據。