赭曲霉毒素A降解酶Af-OTd的酶學性質分析

宋 佳，范 寰，閆 雪，王文杰，趙 晨*

（1 國家糧食和物資儲備局科學研究院 糧食儲運國家工程研究中心 北京 100037 2 天津市畜牧獸醫研究所 天津 300381 3 新希望六和股份有限公司 農業農村部飼料及畜禽產品質量安全控制重點實驗室 成都 610023）

赭曲霉毒素包括7 種結構類似的化合物，其中分布最廣，毒性最大，對農產及食品污染最嚴重，對人類健康影響最大的是赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）[1]。OTA 主要由赭曲霉、青霉、炭黑曲霉等霉菌產生的次級代謝產物[2]，常見于霉變谷物、飼料、咖啡豆、堅果、葡萄等食品中[3-6]，物理和化學性質極其穩定，在產品中很難將其去除或降解[7]。OTA 具有強烈的腎毒性[8]、肝毒性[9]、免疫毒性[10]、致畸性[11]和致癌性[12]，是繼黃曲霉毒素后又一個引起世界廣泛關注的真菌毒素。開發高效環保的脫毒方法，減少或脫除食品及其原料中的赭曲霉毒素A，對提高糧食及食品質量，保障國民食品安全具有重要意義。

生物脫毒主要是通過生物吸附或酶促反應降解毒素或修飾毒素分子結構而達到脫毒的目的，與物理、化學脫毒方法相比，具有特異性強、高效等優點[13]，目前已成為脫毒領域的研究熱點。據相關文獻報道，許多微生物如細菌、酵母菌、絲狀真菌以及一些蛋白酶能夠吸附或降解OTA[14]。其中降解OTA 的過程中可能涉及兩條途徑：（1） 通過水解酰胺鍵生成L-β-苯丙氨酸和OTα 兩種無毒水解產物；（2） 通過內酯環的水解而降解OTA，最終降解產物為開環的OTA 內酯（OP-OTA），與OTA 具有相似的毒性，前者通常被認為是真正的解毒途徑[15]。羧肽酶是最早發現的能夠降解OTA 為無毒產物的一種酶[16]，除此之外，某些過氧化物酶、蛋白水解酶、脂酶都被發現可以降解OTA[17-18]。

本實驗室前期從糞產堿菌中鑒定出一種酰胺水解酶（WP_123049291.1），可高效降解OTA，命名為Af-OTd。本研究將af-OTd 基因在大腸桿菌BL21（DE3）中克隆、表達和純化，并探究溫度、pH、酒精含量、金屬離子等條件對重組表達后的Af-OTd 的酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糞產堿菌、蛋白表達菌株大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）、表達載體pET28a（+），由本實驗室保存；OTA 標準品，青島普瑞邦生物工程有限公司；LA Taq 酶，Takara 生物工程有限公司；Nco Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 連接酶，NEB 生物工程有限公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Gene Explorer PCR 儀，杭州博日科技有限公司；凝膠成像儀、AKTApurifier 蛋白快速純化系統，美國GE 公司；LC-10Avp plus 高效液相色譜儀，日本島津公司；低溫冷凍離心機，美國Beckman 公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質粒pET28a（+）-Af-OTd 的構建 根據NCBI 序列信息，設計引物Af-OTd-F：CAGTC CATGGATGGGCGCCAGTAATCCCATGATG，Af-OTd-R：CAGTCTCGAGCGGCTTTTTGTTCTCCATC。以糞產堿菌基因組為模板擴增目的基因，純化后的DNA 片段和pET28a （+） 質粒分別進行NcoⅠ，Xho Ⅰ雙酶切，膠回收正確片段進行T-4 ligase 連接及電轉化，完成pET28a（+）-Af-OTd 重組載體的構建并轉化至E.coli BL21（DE3）感受態細胞中，測序結果正確的陽性克隆子用于下一步的蛋白誘導表達。

1.3.2 Af-OTd 降解酶的誘導表達 將1.3.1 節測序結果正確的pET28a（+）-Af-OTd 陽性克隆子接種于5 mL LB 液體培養基（kan+質量濃度：50 μg/mL） 中，37 ℃，180 r/min 培養16 h 進行活化。以1%的比例轉種于200 mL 含有相同抗性的LB 液體培養基中，37 ℃，180 r/min 培養至OD600nm=0.6～0.8。將菌液分裝為4 等份于300 mL 搖瓶中，每份40 mL，并 按終濃度0，0.1，0.4，1 mmol/L 添加IPTG，置于25 ℃，180 r/min 過夜誘導表達Af-OTd蛋白。離心收集菌體并用Binding Buffer（20 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑；pH=7.4） 洗滌菌體2 次，10 mL Binding Buffer緩沖液重新懸浮菌體后于冰上超聲破碎。將充分破碎后的菌液4 ℃，12 000 r/min 離心30 min 去除細胞碎片，取上清離心，再次取上清經0.22 μm 濾膜過濾，得Af-OTd 粗酶液。

通過AKTA 蛋白純化系統純化胞內蛋白：用Binding Buffer 平衡Ni+層析柱后，Elution Buffer（20 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L Imidazole；pH=7.4）洗脫目標蛋白，根據洗脫峰收集純化后的蛋白液。將所收集的蛋白液倒入超濾離心管 （3 ku，Millipore） 中，4 ℃，5 000×g 離心3 h，截留的上清液用保存緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，50%甘油；pH=7.4）重懸，-80 ℃保存，用于后續酶活測定。

1.3.3 Af-OTd 降解酶降解OTA 活性測定 取上述酶液990 μL 加入10 μL OTA 儲備溶液（甲醇∶乙腈=1∶1 溶解OTA 標準品，配成1 mg/mL 的標準儲備液），37 ℃分別反應15 min 和30 min 時取樣，HPLC-FLD 檢測OTA 濃度。色譜柱：C18 柱，柱長150 mm×4.6 mm；流動相：乙腈∶水∶冰乙酸= 96∶102∶2；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：激發波長333 nm，發射波長460 nm。

1.3.4 溫度對降解酶Af-OTd 酶活性的影響 以OTA 降解率測定的方法為基礎，設定反應溫度為30，40，50，60，70 ℃。反應體系1 000 μL：990 μL酶液+10 μL OTA 儲備液。將反應體系混勻后于不同溫度下反應15 min 后加入等體積的流動相終止反應。檢測OTA 的殘留量，計算OTA 的降解率，確定最佳反應溫度。

1.3.5 pH 對降解酶Af-OTd 酶活性的影響 以OTA 降解率測定的方法為基礎，設定反應pH 值為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0。反應體系1 000 μL：990 μL 酶液+10 μL OTA 儲備液。將反應體系混勻后于最適溫度下反應15 min 后加入等體積的流動相終止反應。檢測OTA 的殘留量，計算OTA 的降解率，確定最佳反應pH 值。

1.3.6 酒精含量對降解酶Af-OTd 酶活性的影響 以OTA 降解率測定的方法為基礎，設定反應酒精含量為0%，2%，4%，6%，8%。反應體系1 000 μL：910 μL 酶液+80 μL 不同濃度酒精+10 μL OTA 儲備液。將反應體系混勻后于最適溫度和最適pH 條件下反應15 min 后加入等體積的流動相終止反應。檢測OTA 的殘留量，計算OTA 的降解率，確定酒精含量對酶活的影響。

1.3.7 金屬離子及EDTA 對降解酶Af-OTd 酶活性的影響 選取對蛋白酶具有影響作用的常見金屬陽離子Ca2+，Co2+，Cu2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，K+及金屬螯合劑EDTA，加入下述反應體系中，使其終濃度為1 mmol/L。反應體系1：980 μL 酶液+10 μL 100 mmol/L 金屬離子/EDTA 溶液+10 μL OTA 儲備液。反應體系2：980 μL 酶液+5 μL 200 mmol/L金屬離子溶液+5 μL 200 mmol/L EDTA 溶液+10 μL OTA 儲備液。將反應體系混勻后于最適溫度和最適pH 條件下反應15 min 后加入等體積的流動相以終止反應。檢測OTA 的殘留量，計算OTA的降解率，初步確定金屬離子對酶活的影響。

2 結果與分析

2.1 Af-OTd 降解酶的表達與純化

通 過signalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析，Af-OTd 具有信號肽。為獲得胞內表達Af-OTd，設計引物擴增除信號肽外序列，并將信號肽后第一位氨基酸谷氨酰胺（CAA）替換為甘氨酸 （GGC），C 端與6xHis 標簽融合表達。通過PCR 擴增后得到的特異性目的基因條帶與pET28a（+）連接，成功構建pET28a（+）-Af-OTd重組質粒，將質粒轉入E.coli BL21（DE3）中，對陽性克隆測序驗證，測序正確的重組菌株用于后續蛋白的表達純化。

重組菌株菌液分別以0，0.1，0.4，1 mmol/L 的IPTG 誘導，胞內蛋白進行SDS-PAGE 凝膠檢測，結果如圖1a 所示，1～6 泳道均在45 ku 附近出大小與預期相符的蛋白條帶，其中1、3、5 泳道（經IPTG 誘導）條帶比2、4、6 泳道（未經IPTG 誘導）條帶顏色更深，說明Af-OTd 基因在E.coli BL21（DE3）中成功表達，且IPTG 終濃度0.4 mmol/L 為蛋白最適誘導濃度。

圖1 Af-OTd 蛋白SDS-PAGE 凝膠電泳圖Fig.1 SDS-PAGE gel electrophoresis of Af-OTd protein

2.2 Af-OTd 降解酶酶活性的分析

按1.3.3 節反應體系加入Af-OTd 純化后酶液和10 μL OTA 儲備液，OTA 終質量濃度達到10 μg/mL。反應時間2 min 時，HPLC 測定結果如圖2b 所示，與圖2a 相比，保留時間在8 min 左右的OTA 峰明顯縮小，經計算，OTA 降解率超過60%。同時，在保留時間4.5 min 左右出現新峰，根據文獻[19]所述，該峰為降解產物OTα。當反應時間延長至15 min 時，OTA 被Af-OTd 完全降解，該結果說明，純化的Af-OTd 具有高效的OTA 降解活性。

圖2 HPLC 檢測不同反應時間OTA 的色譜圖Fig2 HPLC Chromatograms of OTA for different reaction times

為利于后續酶學特性試驗結果分析，將Af-OTd 酶液用保存緩沖液按照200，400，600，800，1 000 的倍數對酶液進行稀釋，置于相同反應體系中，在反應時間為15 min 和30 min 時，分別加等體積的流動相終止反應。OTA 降解率結果如圖3所示，當Af-OTd 稀釋600 倍，反應時間15 min時，OTA 降解率未到95%，此時，在HLPC 色譜圖中便于觀察OTA 含量；反應時間30 min 時，OTA降解率接近100%，該稀釋度利于對酶活在一定反應時間內進行檢測，故后續試驗使用稀釋600 倍的Af-OTd，取樣時間定為15 min。

圖3 不同稀釋倍數對Af-OTd 酶活性的影響Fig.3 Effects of different dilution times on Af-OTd enzyme activity

2.3 溫度對降解酶Af-OTd 酶活性的影響

Af-OTd 產生菌生存環境在30 ℃，本研究通過檢測Af-OTd 在不同溫度下的降解活性，確定其最適酶活溫度。由圖4可知，隨著溫度的升高，降解酶Af-OTd 對OTA 降解率逐漸升高，當反應溫度為50 ℃時，OTA 降解率達99%，溫度繼續升高，OTA 降解率則呈下降趨勢，故50 ℃為Af-OTd降解OTA 的最適溫度。當高于50 ℃時，Af-OTd活力開始下降，在70 ℃時，OTA 降解率依然可以保持在60%左右，說明高溫可能使酶分子表面構象發生變化，而Af-OTd 已具有較好的耐高溫能力。

圖4 不同溫度對Af-OTd 酶活性的影響Fig.4 Effects of different temperature on Af-OTd enzyme activity

2.4 pH 對降解酶Af-OTd 酶活性的影響

pH 對酶活具有較大影響[20]，因此探究Af-OTd在不同pH 條件下的活性是十分必要的。按1.3.5節反應體系在最適溫度50 ℃條件下反應15 min后終止，計算OTA 降解率。圖5中可知，pH=7.5 是降解酶Af-OTd 的最適pH 值，OTA 降解率最高，堿性增強，OTA 降解率呈下降趨勢，當在pH<7的酸性條件下，降解效率大幅降低，該結果說明Af-OTd 的耐酸性較弱。

圖5 不同pH 值對Af-OTd 酶活性的影響Fig.5 Effects of different pH values on Af-OTd enzyme activity

2.5 酒精含量對降解酶Af-OTd 酶活性的影響

OTA 常見于葡萄酒中[21]，因此本小節通過檢測Af-OTd 在不同酒精濃度條件下對OTA 的降解活性，探究其酒精耐受情況，為后續在葡萄酒生物脫毒領域的應用提供理論基礎。不同酒精濃度的反應體系在pH=7.5，溫度為50 ℃條件下孵育15 min，OTA 降解率結果如圖6所示，酒精會降低降解酶Af-OTd 的酶活力，且隨著反應體系內酒精濃度的不斷加大，OTA 降解率大幅度降低，當反應體系內酒精含量加至8%時，降解酶Af-OTd 的酶活力幾乎降至0，此時為其最大酒精耐受度。

圖6 酒精含量對Af-OTd 酶活性的影響Fig.6 Effect of alcohol content on Af-OTd enzyme activity

2.6 金屬離子及EDTA 對降解酶Af-OTd 酶活性的影響

水解酶類蛋白一般為金屬蛋白，具有金屬中心結構[22-23]。為探究Af-OTd 活性與金屬離子的關系，本試驗使用金屬螯合劑EDTA 及部分金屬離子：Ca2+，Co2+，Cu2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，K+探究其對Af-OTd 酶活性的影響。1 mmol/L 的EDTA 可完全抑制Af-OTd 降解活性，初步判斷該酶為金屬蛋白結構。以未加金屬離子的反應體系為對照，7 種金屬離子對Af-OTd 的酶活都具有抑制效果，其中Co2+，Cu2+，Mn2+，Zn2+抑制效果最為明顯，均超過90%（圖7）。為進一步驗證是否為金屬離子對Af-OTd 酶活產生的影響，在各反應體系中同時加入1 mmol/L 金屬離子和1 mmol/L EDTA，7 種金屬離子對Af-OTd 酶活性的抑制效果均得到緩解（圖7）。

圖7 金屬離子及化學試劑對Af-OTd 酶活性的影響Fig.7 Effects of metal ions and chemical reagents on Af-OTd enzyme activity

添加等摩爾Co2+與EDTA、Zn2+與EDTA 的兩組反應，Af-OTd 酶活性不僅抑制效果被緩解，還呈現出促進效果，初步分析，在調節1 mmol/L EDTA 溶液的pH 值時，EDTA 溶液有微量稀釋，導致反應體系中微量金屬離子剩余促進了Af-OTd 酶活性。為了進一步驗證，分別在反應體系中添加1，10，100，1 000 μmol/L 的Co2+、Zn2+，探究微量金屬離子對Af-OTd 酶活的影響，結果見圖8。Co2+，Zn2+在1，10 μmol/L 條件下，均促進Af-OTd降解活性，當繼續增大濃度到100 μmol/L 時，Co2+，Zn2+再次表現出抑制Af-OTd 酶活。

圖8 Co2+和Zn2+對Af-OTd 酶活性的影響Fig.8 Effects of Co2+ and Zn2+ on Af-OTd enzyme activity

綜上所述，金屬離子對降解酶Af-OTd 的酶活性具有顯著影響，其影響機制將在接下來對Af-OTd 的三維結構解析工作中進行深入分析。

3 結論

將實驗室已獲得的OTA 降解酶Af-OTd 在大腸桿菌中進行重組表達及蛋白純化，并對部分酶學特性進行初步探索。試驗結果表明：Af-OTd 的酶活性受溫度、pH 值、酒精含量和金屬離子的影響。該酶表現出較寬的溫度范圍（30～70 ℃），50℃為其最適反應溫度；該酶在弱堿性條件下的酶活更好，最適pH 值為7.5，酸性條件下酶活受影響較明顯；該酶對酒精呈現一定的耐受能力，當酒精含量為4%時，OTA 降解率仍可維持在60%左右，然而當酒精含量大于8%，OTA 降解率幾乎降為0。而常見赭曲霉毒素A 的葡萄酒酒精含量在8%～15%之間[24]，食品、飼料、包括葡萄酒的pH 值都為中性偏酸性[25]，因此后續試驗應著重通過易錯PCR 或定點突變等手段降低降解酶Af-OTd 的最適pH 值，提高其酒精耐受度，從而提升酶的品質。同時，試驗還發現，Af-OTd 酶活與金屬離子有著密切的關系。一方面，在金屬螯合劑EDTA 及7種金屬離子單獨存在的反應體系中，Af-OTd 的相對酶活力都出現不同程度的下降；另一方面，當EDTA 分別與7 種金屬離子同時在反應體系中時，相對酶活力較前一試驗都有明顯提升。該現象可能與多種作用機制有關，如引起酶蛋白表面電荷的變化，從而影響酶的活性[26]；在此過程中還發現，微摩級的Co2+和Zn2+離子對Af-OTd 酶活性有明顯的促進作用，這可能是Co2+和Zn2+離子作為輔因子與酶形成復合物，成為活性中心的組成部分[27]，也可能是作為酶的激活劑或輔基激活提高酶活力[28]，具體機制還需通過后續試驗進一步分析。

本文實現Af-OTd 異源高效表達并完成該酶的酶學性質的初步探究，為Af-OTd 性能的進一步優化積累了數據，將為促進毒素脫毒酶在相關行業的應用奠定基礎。