大黃魚trim38基因的克隆及其表達分析

茍 濤，王志勇

(1.集美大學水產學院，福建 廈門361021；2.農業農村部東海海水健康養殖重點實驗室，福建 廈門361021)

0 引言

2020年全國大黃魚(Larimichthyscrocea)養殖總產量25.41萬噸，育苗量約24億尾，均居于我國海水養殖魚類首位[1]。經研究，福建和浙江近幾年發生的大黃魚內臟白點病，基本上是由惡臭假單胞菌屬的變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)引起的[2-5]。研究者們建立了LAMP等特異性快速檢測方法[6-8],這有利于盡早介入治療。變形假單胞菌引起的大黃魚內臟白點病對大黃魚養殖產業造成了很大的影響。該病在大黃魚各養殖區廣泛流行，病死率可達50%以上，病魚體表無明顯癥狀，直到有病死或瀕死的個體上浮到海面才會被發覺，此時網箱中多數個體已嚴重感染，病魚陸續死亡，嚴重時整排網箱的魚幾乎死亡殆盡[9-12]。

基于內臟白點病對大黃魚的危害嚴重，本實驗室通過對817尾人工攻毒幼魚進行基因組重測序，挖掘獲得近1×107個SNP，以攻毒后發病時間作為抗病力表型值進行GWAS分析，精細定位了抗病相關區域，并從上述定位的主效區域中篩選出1個抗病相關基因trim38。trim38是TRIM家族蛋白的一員，該家族蛋白是一類存在于胞漿中、含有保守結構域的蛋白質，目前已經發現70多個成員,它們參與細胞增殖、分化、致癌和程序性死亡等多種細胞活動。近年的研究[13]表明TRIM蛋白在人和小鼠等物種中具有很重要的抗菌抗病毒功能。2010年，劉新蕾等[14]首次發現trim38可能作為一個負向調控天然免疫的分子，trim38可以通過與RIG-1相互作用抑制其與下游效應分子IPS-1、TBK1的結合，從而對于干擾素信號通路起到負向調節的作用。trim38可以激活NF-κB的宿主蛋白[15-17]。trim38可以促進K63和K48相關的細胞蛋白泛素化，可在病毒感染過程中被降解[18]。2014年，胡明明等[19]發現trim38是腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素-1(IL-1)觸發信號的關鍵負調節因子。

本研究克隆了大黃魚trim38基因的ORF序列全長，利用實時熒光定量PCR技術檢測該基因在大黃魚不同組織的表達情況以及經變形假單胞菌感染后不同時間的表達情況，為闡明大黃魚在應對變形假單胞菌感染過程中的抗病機制提供了基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用大黃魚于2019年2月采集于福建省寧德市金鈴水產科技有限公司，體重為(28.0±8.0)g。攻毒前，所有魚在水溫18℃，鹽度25左右的條件下馴養1周。動物實驗操作遵循集美大學水產學院動物倫理委員會的要求進行。

人工攻毒實驗所用變形假單胞菌菌株分離于自然發病魚，由集美大學水產學院鄢慶枇教授惠贈。攻毒前，將-80℃條件下保存的菌株復蘇并接種于含2%NaCl的LB液體培養基，在恒溫搖床中180 r/min、37℃培養至OD值A600為1.0左右。用紫外可見分光光度計測量菌液濃度。

1.2 實驗試劑

RNA提取試劑盒(TransZol Up Plus RNA Kit)購自北京全式金生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒(GoScriptTMreverse transcription system protocol，promega)購自上海泰京生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒和無內毒素質粒小量提取試劑盒購自北京天漠科技開發有限公司；高保真酶(2×Phanta?Max Master Mix)、一步克隆試劑盒(ClonExpress?II One Step Cloning Kit)和熒光定量染料(ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；引物由廈門鉑瑞生物科技有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 大黃魚樣品采集

組織表達譜分析：從暫養群體中隨機選取6個正常個體,用丁香酚麻醉后，將魚體置于冰上，用75%酒精擦拭體表，依次剪取鰓、鰭條組織；隨后立即將魚體解剖，依次取脾臟、肝臟、腸、腎臟和頭腎組織；最后沿大黃魚頭部中線剪開，采集腦組織。將所有樣品放置于RNA保護液中，-80℃保存備用。

變形假單胞菌攻毒實驗：將培養至1.0×109CFU/mL的變形假單胞菌菌液均勻潑灑到攻毒實驗池(池子面積4 m×2 m×0.8 m,水深20 cm)中，至池中菌液終濃度為1.0×106CFU/mL，使細菌與魚充分接觸，并保留一部分不予以攻毒的魚作為對照組。細菌感染過程持續3 h之后，將所有攻毒實驗魚轉移到裝有潔凈曝氣海水的池子中，維持攻毒前的水溫和鹽度繼續養殖，分別在攻毒后3,6,12,24,48,72,96,120 h，在對應的時間點從攻毒組隨機撈取6尾大黃魚，用丁香酚麻醉后快速解剖取其腎臟、脾臟和肝臟，置于RNA保護液中，保存在-80 ℃的冰箱中備用。

1.3.2 總RNA提取及cDNA的合成

采用TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒提取大黃魚組織樣品及經變形假單胞菌感染后的總RNA，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA的第一條鏈。用大黃魚管家基因β-actin檢測反轉錄效果。引物見表1。

表1 本研究中使用的引物

1.3.3 大黃魚trim38基因的克隆

從本實驗室的大黃魚基因組測序數據庫中獲得trim38基因的開放閱讀框(ORF)序列，據此設計trim38-F/R引物(序列見表1)，以大黃魚腎臟cDNA為模板擴增trim38。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收并連接入pMD19-T，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性菌落送到廈門鉑瑞生物科技有限公司進行測序，以驗證序列結構。用DNAMAN軟件對測序結果和參考序列進行比對分析，并使用Primer Premier 5.0軟件(http://www.premierbiosoft.com)設計熒光定量PCR引物qtrim38-F/R(序列見表1)。

1.3.4 大黃魚trim38基因的生物信息學分析

在網站http://Web.expasy.org/cgi-bin/protparam上分析蛋白質的物理參數；在網站http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/上預測信號肽；用DNAMAN軟件分析序列同源性；在網站http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi上預測蛋白結構域；用BioEidt軟件做氨基酸多重序列比對；用MEGA 6.06軟件構建系統進化樹。

1.3.5 實時熒光定量PCR

根據trim38 cDNA序列設計實時熒光定量PCR引物qtrim38-F/R，用稀釋50倍的cDNA為模板，選擇大黃魚β-actin基因作為內參基因進行熒光定量PCR(引物序列見表1)，按照熒光定量染料ChamQTMniversal SYBR?qPCR Master Mix說明書進行操作，反應體系：ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix 10.0 μL，qtrim38-F/R各0.5 μL，cDNA模板4.0 μL，加ddH2O至20.0 μL。每個樣品進行3個生物學重復，3個技術重復，以確保數據的穩定性。在StepOnePlus 熒光定量PCR儀(美國 Application Biosysterms 公司)上進行qRT-PCR反應，擴增程序為：95 ℃預變性30 s，然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環。

對實時熒光定量PCR結果，采用2-ΔΔCt方法計算每個樣品目的基因的相對表達量。

2 結果

2.1 trim38基因的結構

克隆獲得大黃魚trim38基因ORF長度為1623 bp，編碼540個氨基酸(見圖1)，蛋白理論大小為61.58 ku，等電點6.99。SignaIP-5.0 Server和TMHMM Server V.2.0預測結果發現TRIM38蛋白沒有信號肽和跨膜區。

NetPhos 3.1 Server預測出TRIM38蛋白含有58個磷酸化位點，其中包括36個絲氨酸(Ser)磷酸化位點，14個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點,8個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(見圖1)。通過SMART預測表明，TRIM38蛋白從N端到C端依次排列，分別含有1個RING結構域、1個B-box結構域和一個PRYSPRY結構域(見圖2)。表2為大黃魚與其他物種trim38氨基酸序列比較分析結果，從表2中可見，黃姑魚trim38基因與大黃魚trim38基因同源性最高，為86.86%；其次是棘頭梅童魚(84.96%)和鱖魚(68.63%)。系統進化樹(見圖3)分析結果顯示，魚類和哺乳類的trim38各自聚為一支，大黃魚trim38與黃姑魚的親緣關系最近。

表2 大黃魚與其他物種trim38氨基酸序列的同源性分析

2.2 trim38基因在不同組織的表達分析

以大黃魚β-actin基因為內參，利用實時熒光定量PCR檢測大黃魚trim38基因在鰓、鰭、頭腎、腦、脾、肝、腸和腎共八個組織/器官中的表達情況，結果如圖4所示。大黃魚trim38基因在腎臟中相對表達量最高，其次為肝臟和頭腎,在其他組織中的相對表達量較低。

2.3 trim38基因在經變形假單胞菌感染后不同時間的表達分析

利用實時熒光定量PCR檢測大黃魚trim38基因經變形假單胞菌感染0，3，6，12，24，48，72，96，120 h后的相對表達量，結果如圖5所示。在變形假單胞菌攻毒后，trim38在大黃魚肝臟與脾臟中的相對表達量迅速提升。在肝臟3 h的相對表達量就達到高峰且達對照組的5.7倍，其后迅速下降，12 h后又逐漸增高，72 h時約增加到開始時的3.0倍，形成1個次高峰，其后又逐漸下降。在脾臟中，攻毒后3 h相對表達量迅速增加到開始時的4.2倍，其后略有下降，但一直維持在開始時的2倍乃至3倍以上，在120 h又大幅度增加到開始時的6.8倍，達到峰值。在腎臟中3 h的相對表達量顯著降低，6 h之后恢復至正常水平，其后在起始值的0.5～1.3倍之間波動，在96 h達到最大值，為起始時的1.3倍。

3 討論

本研究首次克隆出大黃魚trim38開放閱讀框(ORF)全長，其ORF長度為1623 bp，編碼540個氨基酸，理論等電點為6.99。生物信息學分析結果表明,trim38具有TRIM家族的主要特征：RING結構域、B-box結構域和PRYSPRY結構域，從N端到C端依次排列。RING結構域是介導蛋白泛素化[21]，可以激活RIG-I信號通路；B-box結構域能結合鋅離子；PRYSPRY結構域的功能是介導蛋白質之間相互作用[22]。系統進化分析發現魚類和哺乳類的trim38各自聚為一支。大黃魚trim38基因與同屬于石首魚科的黃姑魚和棘頭梅童魚trim38基因同源性較高，與哺乳動物trim38基因同源性相對較低。這可能是因為不同物種所處環境不同，面對不同的環境選擇壓力，導致不同的進化速度和進化方向[23]。

熒光定量PCR結果顯示，trim38基因的mRNA廣泛分布于所檢測的大黃魚8種組織或者器官中，在腎臟中相對表達量最高，其次為肝臟和頭腎。說明大黃魚trim38基因在免疫相關組織中高度表達。其同家族基因在大黃魚中也有類似的作用，例如周真真等[24]報道，大黃魚TRIM25蛋白在肝臟和頭腎相對表達量高。腎臟和肝臟是魚類的重要免疫器官，上述結果提示trim38在大黃魚免疫應答過程中發揮著重要作用。

研究發現，TRIM蛋白家族具有很重要的抗菌抗病毒功能，在病毒感染的先天免疫反應中發揮重要作用[25-26]。如trim38通過靶向TRIF降解負性調節TLR3介導的IFN-β信號[27]。TRIM25泛素化可通過正調控激活IRF1促使IFN-β的產生，且能顯著激活RIG-I信號通路上的RIG-I和MAVS等基因的上調。TRIM25泛素化激活發揮了抗病毒作用[28]。TRIM37可能通過抑制Wnt/β-catenin通路從而抑制腫瘤的生產[29]。TRIM22在膠質母細胞瘤中可以通過激活PI3K/AKT信號通路和EMT過程來推動腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移[30]。本研究大黃魚感染變形假單胞菌后主要的病變組織器官是脾臟、肝臟和腎臟。在脾臟中，攻毒3 h后相對表達量迅速增加到開始時的4.2倍，其后略有下降，但一直維持在開始時的2倍乃至3倍以上，到高表達后仍持續表達，在120 h又大幅度增加到開始時的6.8倍，達到峰值。該基因在脾臟中表達顯著，可能與脾臟作為大黃魚應對變形假單胞菌感染的主要靶器官有關[3、31]。在肝臟，攻毒3 h時相對表達量就達到高峰，達對照組的5.7倍，其后迅速下降，12 h后又逐漸增高，72 h時約增加到開始時的3.0倍，形成1個次高峰，然后又逐漸下降。在腎臟中，攻毒3 h時相對表達量降低，3 h之后相對表達量上升，在96 h達到最大值，為起始時的1.3倍。初步推測大黃魚trim38基因有可能參與了大黃魚抗內臟白點病的免疫應答。

蛋白質泛素化與許多重要的生命過程有密切關系，現已知道其參與信號傳導、細胞免疫、炎癥反應和調控基因轉錄等等。研究發現，trim38是一種天然免疫調節劑[32]。作為負調控因子，trim38蛋白介導賴氨酸48(K48)連接的TNF受體相關因子6、TRIF和NF-κB激活激酶相關蛋白1的泛素化，促進其蛋白酶體降解，從而抑制TLR和RLR通路。此外，trim38促進溶酶體依賴的TAK1結合蛋白2(TAB2)在TNF和IL-1b觸發的信號中降解，不依賴于它的E3泛素連接酶活性[18]。

但是，關于trim38基因在大黃魚應對變形假單胞菌感染的免疫應答過程中行使怎樣的功能，以及具體的免疫抗病機制，還需進一步的研究闡明。本文為深入研究trim38基因在大黃魚應對變形假單胞菌感染的抗病免疫機制提供了基礎資料。