中國南方稻谷主產區黑曲霉菌群的流行特征及產毒能力研究

張 婷, 徐圓程, 王光宇, 汪海峰, 印曉玉, 邱偉芬

(南京財經大學食品科學與工程學院，南京 210023)

稻谷是我國重要的糧食作物之一，在我國國民經濟中占有極其重要的地位[1]。隨著我國將糧食安全戰略納入“十四五”規劃，糧食產后的收儲保質減損重要性日益凸顯。黑曲霉群(A.nigeraggregate)是儲藏稻谷中的優勢菌群，不僅會導致糧食霉變造成經濟損失，部分菌株還能產生赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)危害人類健康[2]。因此，有必要對我國稻谷主產區儲存糧堆中黑曲霉群的流行特征進行調查并分析它們的產毒能力，為我國稻谷的安全儲藏和霉菌針對性防控提供數據參考。

黑曲霉群主要的形態特征是產生黑色的分生孢子頭，通常能形成典型的黑色或深棕色菌落。食品中常見的黑色曲霉主要包括黑曲霉(A.niger)、塔賓曲霉(A.tubingensis)和巴西曲霉(A.brasiliensis)等10種。這類形態種之間具有高度的生物多樣性但種間差異非常微小[3]。此外，菌落的顏色還受到培養基、培養時間、產孢量和菌核等因素影響。因此，僅依靠表型特征無法區分黑曲霉群中的物種。針對黑曲霉群的系統發育和分類學的研究表明，要準確鑒定黑色曲霉除了需要對分離株的微觀形態進行表征外，還需要對ITS和一些蛋白基因(如BenA和CaM)進行測序[4,5]。Susca等[6]通過形態學結合BenA和CaM基因對美國和意大利兩國玉米中黑曲霉群進行鑒定，發現黑曲霉、塔賓曲霉和百歲蘭曲霉是兩國玉米中最常見的黑色曲霉，但組成比例上有差異。而Noonim等[7]發現泰國兩個不同地區的咖啡豆中的黑曲霉群為A.aculeatinus、炭黑曲霉(A.carbonarius)、黑曲霉、塔賓曲霉和A.sclerotiicarbonarius共5種。由此可知，黑曲霉群的分布特征與地理環境、氣候差異等因素相關。傳統上認為，谷物中的OTA通常由赭曲霉(A.ochraceus)和純綠青霉(Penicilliumverrucosum)產生[8]，但越來越多的研究發現，黑曲霉群也可以在谷物及其副產物中生長繁殖并產生OTA[9]。此外，研究還發現不同地理、氣候環境中存在的分離株，產OTA的能力也各不相同。OTA產毒基因簇由五個基因組成，分別是編碼鹵素酶(HAL)、bZIP轉錄因子(bZIP)、細胞色素單加氧酶P450、非核糖體肽合成酶(NRPS)和聚酮合成酶(PKS)[10,11]。OTA的產生與否及產生能力的強弱除基因水平上的因素外[12]，還會受到溫度、水分等因素的影響[13]。因此，不同地理位置分布的黑曲霉群均可能導致OTA污染風險。到目前為止全球發現的黑色曲霉中炭黑曲霉[14]、A.lacticoffeatu[15]、黑曲霉[16]和百歲蘭曲霉[17]均有過產生OTA的報道。地理位置及氣候環境會影響黑曲霉群的分布，但這些黑色曲霉僅依靠外觀特征和ITS測序難以準確鑒定到種。目前國內對于稻谷等儲藏糧堆的樣品采集范圍較小，對優勢菌種的分類鑒定多數依靠外觀及ITS測序，導致我們對倉儲稻谷中黑曲霉群的分布信息并不明確，且它們的分布規律和產OTA能力鮮有系統研究。

本研究采集我國南方十省的倉儲稻谷樣品，通過形態特征篩選出黑曲霉群菌株，進一步依據ITS及CaM序列特征對其進行鑒定，明確其進化關系及分布規律；采用ELISA、HPLC-FLD方法并結合OTA生物合成基因鑒定方法確證黑曲霉群分離株的產OTA能力，該研究結果為我國稻谷的安全儲藏及霉菌針對性防控提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻谷樣品采集自我國南方稻谷主產區10個省的代表性糧庫。

高鹽察氏培養基(HCA)、察氏培養基(CA)；基因組DNA提取試劑盒；2×Rapid Taq Master Mix；TAE緩沖液；氯化鈉、氯化鉀、七水合硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、無水乙醇、三水合磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、蔗糖(分析純)；酵母提取物；甲醇(色譜純)；OTA標準品。

1.2 儀器與設備

MJ-150F-I霉菌培養箱，VOSHIN-600R無菌均質機，SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，VeritiPro梯度PCR儀，BIO-RAD Mini-sub Cell電泳槽，BIO-RAD Gel Doc XR凝膠成像儀，ELX800酶標儀，1260高效液相色譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

于2017年3月—2019年11月在我國南方10個省江蘇、浙江、福建、四川、安徽、湖南、湖北、江西、廣東和廣西的14個代表性糧庫，采集樣品共計525份。糧庫為高大平房倉。采用三層五點法分層分點進行扦樣，每份樣品300 g。三層為距糧堆地面0.5 m的下層，距糧堆表面2.5 m的中層，距糧堆表面0.5 m的上層。五點為每個糧層距離兩邊墻壁均為1 m的4個角落和中心點，共5個采樣點。取得的樣品用無菌采樣袋封裝后于4 ℃保藏運送至實驗室。

1.3.2 霉菌的分離與純化

在無菌環境中稱取25 g稻谷樣品裝于無菌均質袋中，用225 mL無菌水攪勻作為原液，稀釋度為10-1。然后吸取1 mL至9 mL無菌水中制成10-2的稀釋液，連續梯度稀釋3次后得到濃度為10-5的樣品稀釋液。取此稀釋度菌液稀釋液制成平板，于霉菌培養箱中28 ℃培養7 d。根據霉菌菌落的形態學特征，選取培養皿上的黑色或深棕色菌落，將其劃線分離純化培養，最終純化得到單一的黑曲霉群菌株。一部分用于1.3.3中的菌株鑒定實驗，另一部分以孢子懸浮液的形式儲存，于2 mL凍存管中加入40%滅菌的甘油，比例為1∶1，混合均勻后保藏于-80 ℃超低溫冰箱中，供1.3.5的產毒培養實驗使用。

1.3.3 菌株鑒定

將20 mg菌絲體從培養皿中取出，轉移至1.5 mL離心管中，按照說明書使用試劑盒提取黑曲霉菌株基因組DNA，在超凈臺進行操作，收集至離心管中。對所提取的DNA進行PCR擴增，引物為ITS1/ITS4和cmd5/cmd6(表1)。PCR反應體系及程序參照文獻[18]。對所得擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析并在化學發光成像儀上觀察結果，鑒定擴增產物的完整性。所有擴增產物均由上海生工生物工程股份有限公司進行測序，將測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對分析。

表1 擴增引物序列表

1.3.4 系統發育分析

使用MEGA 11軟件對序列進行系統發育分析。首先通過Clustal W程序進行多重序列比對，然后選擇最大似然法(Maximum Likelihood, ML)構建系統發育樹。使用Tamura-Nei模型經過1 000次bootstrap評估其穩定性后獲得系統發育樹。

1.3.5 霉菌的產毒培養

取出預先制備好的黑曲霉群菌株孢子懸浮液，置于4 ℃冰箱儲存備用。CYA產毒培養基參照Hübsch[21]的方法進行配置，用無菌生理鹽水將黑曲霉群菌株孢子懸浮液濃度調整至106CFU/mL。取5 μL懸浮液滴于平板中央，28 ℃恒溫培養7 d，一式3份。

1.3.6 ELISA法測定OTA產生能力

使用ELISA試劑盒對107株黑曲霉菌株產OTA能力進行定性檢測。從產毒培養基菌落的中心、中圈、外圈各取1塊帶菌瓊脂塊，將其置于2 mL離心管中，通過加入1 mL 60%甲醇提取OTA，每10 min震蕩一次直至提取完畢，提取時間為1 h，然后離心得上清液，用ELISA試劑盒檢測菌株產毒情況。按照ELISA試劑盒制造商給出的說明書進行操作，制作標準曲線并進行數據分析。

1.3.7 HPLC-FLD法測定OTA產生能力

采用高效液相色譜法對107株菌株的OTA進行定量分析。取樣方法同1.3.6，用1 mL甲醇提取。采用反相C18色譜柱(5 μm，250 mm，4.6 mm，柱溫45 ℃)、高效液相色譜(HPLC)、FLD熒光檢測器(激發波長333 nm，發射波長460 nm)測定提取物中OTA含量。流動相為KH2PO4(4 mmol/L pH 2.5)和甲醇，比例為33∶67，流速為1 mL/min。通過與OTA標準品生成的校準曲線比較，對OTA進行洗脫和定量。加標回收實驗通過將已知濃度的OTA加到底物中，并按照與樣品相同的程序提取毒素來進行。

1.3.8 OTA生物合成關鍵基因的鑒定

參考Gil-Serna等[18]報道的鑒定方法，在所有分離株中檢測OTA合成關鍵基因的存在，步驟同1.3.3，通過引物擴增產生的條帶評估黑曲霉、塔賓曲霉、百歲蘭曲霉和新黑曲霉菌株OTA生物合成基因的缺失。兩組引物分別針對位于OTA生物合成基因簇兩側的異丙醇脫氫酶(IDH)和氧化氮合酶(ONS)編碼基因，其中引物ISODH-PKSTUBF/R對塔賓曲霉具有特異性，而ISODH-PKSF/R則對黑曲霉和百歲蘭曲霉具有特異性(表1)。

1.3.9 統計學分析

所有實驗均為3個重復，數據以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析(ANOVA)。對結果進行分析，P<0.05表示差異顯著。采用SPSS 19.0對結果進行統計處理。

2 結果與分析

2.1 黑曲霉群菌株分布與流行特征

黑曲霉群疑似菌株提取基因組擴增出的ITS序列和CaM序列呈現的條帶完整明亮，大小分別為600 bp左右和580 bp左右，符合測序要求。霉菌形態學對比和目標基因測序結果表明，在我國南方稻谷主產區代表性糧庫中采集到的107株黑曲霉群分離株全部屬于曲霉屬。CaM測序分析結果將其分為4個種，分別為黑曲霉、塔賓曲霉、百歲蘭曲霉、新黑曲霉，其中黑曲霉有37株，塔賓曲霉有13株，百歲蘭曲霉有55株，新黑曲霉有2株。

注：a為新黑曲霉，b為黑曲霉，c為塔賓曲霉，d為百歲蘭曲霉。

我國稻谷主產區大部分分布在長江以南、年平均氣溫較高的省份，豐富的降雨量使得這些地區氣候濕潤，這樣的環境條件特別適宜霉菌的生長繁殖[22]。而黑曲霉群的菌株尤其適應在溫暖的氣候條件下生存，其黑色的孢子在陽光和紫外線下能夠受到很好的保護，為它們在溫暖氣候條件下提供了競爭優勢[23, 24]。黑曲霉群菌株普遍存在于倉儲糧堆當中，這些黑色曲霉種的污染水平及分布特征通常會受到地理環境、氣候特征等因素影響。

在本研究中，結合各采樣地點地理環境信息分析可以發現，黑曲霉群分離株的分布呈現出明顯的地區差異。從各地區黑曲霉群菌株的種類數量來看，有4個地區檢測出了3種黑色曲霉，有2個地區只檢測出了1種黑色曲霉。從地域分布來看，百歲蘭曲霉分布最廣，尤其在兩廣地區檢出最多。其次是黑曲霉，近半數分布在廣西南寧、廣東雷州這2個地區?？梢姾谇购桶贇q蘭曲霉在廣西和廣東地區流行率都比較高。這兩個省份屬于我國第七儲糧生態區高溫高濕儲糧區，一年當中15 ℃以上的時間在289～352 d，是我國“濕熱”的地區。這說明黑曲霉群中的黑曲霉和百歲蘭曲霉2個物種尤其喜愛高溫高濕的環境，這種條件下的儲糧尤其需要防范這兩種霉菌。

從黑曲霉群菌株的檢出數量來看，百歲蘭曲霉最多，占51.40%，其次是黑曲霉和塔賓曲霉。相關研究證實，百歲蘭曲霉、黑曲霉和塔賓曲霉是谷物中分布最普遍的黑色曲霉種[18, 25]，這與本研究結果相似。除谷物以外，百歲蘭曲霉還是葡萄[26]、洋蔥[27]等其他農產品中流行率最高的黑色曲霉。值得注意的是，百歲蘭曲霉在2011年才從黑曲霉中劃分出來[28]，最近幾年才在全球范圍內大量報道，主要原因可能是由于大多數研究在百歲蘭曲霉的分類信息出現或者受到關注之前就已經發表。因此，目前仍然迫切需要對黑色曲霉的流行情況重新進行評價[29]。Massi等[30]將之前研究中被鑒定為黑曲霉的175株分離株，利用CaM測序對其進行重新鑒定后，發現其中有一半實際上是百歲蘭曲霉。

本研究所分離到的塔賓曲霉也是稻谷中的主要黑色曲霉。Amani Lahouar等[31]研究表明，塔賓曲霉在谷物中普遍存在且檢測頻率較高，這與意大利[32]等國家的研究結果一致，在這些國家儲糧樣品中分離到的黑色曲霉中數量最多的是塔賓曲霉。結合地理特征分析后發現鑒定到的塔賓曲霉大多分布在高緯度的地區，且緯度越高塔賓曲霉的流行率越高，表明黑曲霉群種類的分布確實與地理位置、氣候條件等因素相關。除近期被廣泛報道的黑曲霉群種類外，本研究中還分離到了兩株新黑曲霉，分布在湖南長沙和廣東雷州2地。新黑曲霉在形態上與黑曲霉和塔賓曲霉相似[33]，但能夠形成白色菌核，在工業中常用它來發酵普洱茶。

2.2 系統發育分析

將所有序列在NCBI中比對后進行系統發育分析。系統發育結果大致將所分離到的黑曲霉群分為兩大類，塔賓曲霉和新黑曲霉屬于一個分支，而黑曲霉和百歲蘭曲霉屬于另一個分支，表明它們兩兩之間的親緣關系接近。值得注意的是，在系統發育樹中，各分離自江西贛州的黑曲霉(37)JXGZ18 3和廣東雷州的黑曲霉(87)GDLZ17 8分離株親緣關系與其他黑曲霉菌株較遠。除此之外，其他分離自不同地區的黑色曲霉分離株均按種聚類到一起。

系統發育分析表明黑曲霉和百歲蘭曲霉屬于一大分支，且它們的種內變異性明顯低于塔賓曲霉。這與以往報道的遺傳關系一致[34]，表明它們之間的親緣關系更加接近。結合樣品采集信息，黑曲霉和百歲蘭曲霉的分布規律也是同步的，這可能由于2種黑色曲霉基因組成接近，有關基因功能均能夠讓它們適合在高溫高濕環境中生長。綜合來看，溫濕度對我國南方地區倉儲稻谷中黑曲霉群流行特征的影響較大。Battilani[35]和Chiotta[36]分別研究了歐洲和阿根廷不同地理區域對黑曲霉群流行情況的影響，發現各地溫度和濕度的差異是引起這種地域性差異的主要原因。我國南方十省稻谷主產區由北向南所涉區域從溫帶地區跨到了熱帶地區的兩廣，緯度變化形成了較大溫度差異，也就造成了各地糧庫中黑曲霉群分布情況的不同。

2.3 黑曲霉群分離株產OTA能力評估

對107株黑曲霉群分離株進行ELISA法測定，所得標準曲線線性良好。線性方程為y=-44.433x+35.591，相關系數R2=0.996 1，說明可用于定量檢測。加標回收實驗測得回收率為88.67%～98.78%，RSD為2.16%～4.83%。ELISA測定產OTA能力結果如表3所示，來自5個不同地區的7株菌顯示陽性，它們的產毒量在1.33 μg/kg到5.05 μg/kg之間。

表3 全部菌株產毒情況

ELISA是食品中OTA檢測的常用方法，其原理是基于抗原抗體特異性反應以及酶的催化作用[37]。該法具有檢測速度快、成本低的優點，但在進行大批量樣品檢測時容易出現假陽性的結果，且重復性差。原因涉及多方面因素，如與樣品結構類似的化合物間的交叉反應會影響測定結果的準確性[38]，酶不穩定且易失活等。因此仍需采用其他方法進行確證。液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)作為真菌毒素分析的金標準方法[39]，靈敏度和準確度高，特異性強，自動化程度高，是許多實驗室OTA檢測的首選方法[40]。

使用HPLC-FLD對107株菌株的OTA提取液進行檢測，得到標準曲線線性方程為y=0.126 4x+0.000 1，R2= 0.999 8，在0～100 μg/L范圍內呈良好線性關系。加標回收實驗結果顯示加標回收率為89.54%～98.42%，相對標準差(RSD)為3.56%～5.62%，說明本法滿足實驗測定。HPLC-FLD結果如表2所示，107株菌株均未檢測到OTA，針對此結果，繼續通過提取這些菌株基因組DNA進行OTA生物合成基因鑒定來驗證。

表2 黑曲霉群分離株分布特征

OTA生物合成基因主要由編碼鹵素酶(HAL)、bZIP轉錄因子(bZIP)、細胞色素單加氧酶P450、非核糖體肽合成酶(NRPS)和聚酮合成酶(PKS)這5個基因組成，所用引物擴增的是OTA生物合成基因和其上下游片段。當OTA生物合成基因缺失時，PCR引物擴增會產生1 000 bp左右長的條帶，說明所測菌株無法合成OTA。OTA生物合成關鍵基因鑒定結果表明，所有菌株PCR擴增后在1 000 bp左右均有明亮條帶產生，表明所有菌株均缺失OTA生物合成關鍵基因，不能產生OTA，與HPLC-FLD結果一致。

圖2 OTA生物合成基因鑒定圖

OTA是一種具有腎毒性和潛在致癌性的真菌毒素，多存在于谷物、咖啡豆、可可豆、葡萄、干果和香料等多種食品中[41]，不同地理位置分布的黑曲霉群菌株均可能導致OTA污染的潛在風險。本研究中HPLC-FLD和OTA合成基因鑒定結果都表明所有菌株均不產生OTA，說明ELISA檢測結果呈假陽性。因此，我國南方區域黑曲霉群造成的OTA污染風險較低，且宿主來源與產生OTA的能力也無明顯關系。此外，這一結果還證實了基于PCR的分析有助于更簡易方便地預測黑曲霉群OTA的產生能力。

雖然越來越多的研究發現黑色曲霉有產生OTA的能力，但綜合現有的研究，這些產毒菌株只占了分離到黑色曲霉中的一小部分。許多黑曲霉群分離株缺少OTA生物合成基因，基因組中只保留了編碼PKS中很小一部分無有效功能的序列，而黑曲霉群菌株不能產生OTA正是與其基因組中功能基因的缺失相關[42]。根據本研究中系統發育分析結果也可以做出一些推測，這些不產OTA的黑色曲霉的祖先出現了OTA合成基因簇缺失的情況，在進化過程中使得這些物種的毒素合成能力以不同程度或速率喪失。因此導致黑色曲霉中產OTA菌株可能并不普遍，只有百歲蘭曲霉和黑曲霉等少數菌株被報道擁有完整的OTA合成基因簇[43, 44]。而塔賓曲霉產OTA的能力也一直備受爭議，雖然有其產OTA的文獻報告[45]，但也有學者一直在討論它能否真正的產OTA[46]。在Qi等[47]的研究中，所分離的塔賓曲霉均不產OTA。Nielsen等[48]的研究報告中也提到塔賓曲霉不能產生OTA。

雖然本研究中分離到的所有黑色曲霉均不能產生OTA，但需要注意的是，黑曲霉是工業發酵中最重要的微生物之一[49]。傳統上認為它在工業條件下是無毒安全的，目前已經有相當多的黑曲霉發酵產品被美國食品和藥品管理局授予了一般認為是安全的(generally regarded as safe, GRAS)證明。然而，在黑色曲霉中存在的產OTA和伏馬菌素[50]的潛力，需要調整和加強工業發酵菌種的多種真菌毒素的篩選程序。

3 結論

糧食安全是全球普遍關注的研究課題。稻谷是我國重要的儲備糧食作物，預防儲糧霉變和防范真菌毒素污染對于我國的經濟發展和人民健康具有重要意義。雖然農業收獲技術的改進以及儲糧霉變實時監測技術的應用大大降低了糧食霉變的幾率，但霉變造成的儲糧品質下降和經濟損失仍不容忽視。本研究對中國南方稻谷主產區倉儲稻谷中的黑曲霉群進行分離鑒定，分析其分布規律及流行特征，并評估其產OTA毒素的能力。綜合結果來看，雖然未發現產OTA的黑色曲霉，但霉變帶來的儲糧數量損失和質量下降仍不容忽視，我們應對黑曲霉群繼續保持監測和科學評估，才能有效防范OTA等真菌毒素污染的潛在風險。