禾谷鐮刀菌拮抗放線菌21-3 的篩選及鑒定

張艷茹,郎劍鋒,郭富超,王鵬,韓陽超,張強

（1.河南科技學院資源與環境學院,河南 新鄉 453003;2.新鄉工程學院生物工程學院,河南 新鄉 453700）

由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）侵染引起的小麥赤霉病是小麥生產上的一種重要病害,受氣候變化、耕作制度及抗病品種缺乏等多種因素的影響,該病害在我國長江中下游和黃淮麥區頻繁流行,嚴重影響小麥的安全生產[1-2].除造成作物減產之外,禾谷鐮刀菌還可產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）及玉米赤霉烯酮（ZEN）等毒素,進而危害食品安全[3].

雖然生產上缺少抗病品種,但使用化學防治等多種措施相結合的方式也在一定程度上減少了小麥赤霉病的發生.近年來,利用微生物及其衍生物進行生物防治的措施也受到研究者的廣泛關注[4-5].已有大量研究發現,芽孢桿菌屬、假單胞菌屬及鏈霉菌屬的多個菌株對禾谷鐮刀菌都具有很好的抑制效果.例如,解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）AX-3 對禾谷鐮刀菌具有較強的拮抗能力,而且能夠產生抗菌物質macrolactin A[6].貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）ZQT-31 能夠抑制禾谷鐮刀菌的正常生長,并導致菌絲出現畸形[7].綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）ZJU60 分泌的吩嗪-1- 甲酰胺可以直接影響組蛋白乙酰轉移酶FgGcn5 的活性,從而抑制禾谷鐮刀菌的生長與毒素合成[8].鏈霉菌（Streptomyces sp.）DEF09 能夠有效控制小麥赤霉病的發生[9].草地鏈霉菌（S. pratensis）S10 對禾谷鐮刀菌的菌絲生長和DON毒素都具有抑制作用[10].本研究從土壤中分離到1 株對禾谷鐮刀菌具有明顯拮抗作用的鏈霉菌21-3,通過對該菌株拮抗活性進行研究,以期為小麥赤霉病的生物防治提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株:禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、瓜類炭疽病菌（Colletorichum lagenerium）、大斑凸臍蠕孢（Exserohilum turcicum）、假禾谷鐮刀菌（F. pseudograminearum）、美澳型核果褐腐菌（Monilinia fructicola）、粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）、灰略紅鏈霉菌（Streptomycetaceae griseorubens）21-3均為河南科技學院資源與環境學院植物病理學實驗室分離保存菌株.

PDA 培養基:馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g、水1.0 L.

YG 培養基:葡萄糖10.0 g、酵母提取物10.0 g、瓊脂15.0 g、水1.0 L、pH 值為7.0.

高氏1 號培養基:可溶性淀粉20.0 g、K2HPO40.5 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KNO31.0 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂15.0 g、水1.0 L.

KMB 培養基:蛋白胨20.0 g、甘油10.0 g、K2HPO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、水1.0 L、pH 值為7.2.

發酵培養基:葡萄糖25 g、蛋白胨25.0 g、酵母提取物5.0 g、MgSO4·7H2O 2.0 g、K2HPO4·3H2O 2.0 g、KH2PO42.0 g、CaCO35.0 g、水1.0 L、pH 值為7.2.

1.2 拮抗放線菌的分離篩選

土壤樣本于2021 年1 月采集于河南科技學院東區試驗田小麥根際土壤,并在河南科技學院資源與環境學院植物病理學實驗室進行后續試驗.土壤樣本用無菌水進行梯度稀釋,將不同梯度稀釋液涂布于含有質量濃度為50 mg/mL 的重鉻酸鉀的高氏1 號培養基表面,28 ℃條件下培養7 d 后,挑取不同單菌落進行劃線純化.

1.3 菌株21-3 的分類鑒定

1.3.1 形態及生理生化鑒定 具體方法參照《放線菌快速鑒定與系統分類》[11]進行.

1.3.2 分子生物學鑒定 利用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACC TTGTTACGACTT-3′）對菌株21-3 的16S rDNA 序列進行PCR 擴增.擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化測序.獲得序列后,在GenBank 數據庫比對并下載相關菌株的16S rDNA 序列.采用ClustalX 1.83 軟件進行比對分析后,用Mega 7.0 軟件采用鄰接法構建系統發育樹.

1.4 菌株21-3 無菌發酵液的獲得

菌株21-3 在高氏1 號培養基上生長7 d 后,用打孔器獲取2 個1 cm 大小的菌餅,分別接種在50 mL PDB 等不同培養基中,28 ℃、180 r/min 培養5 d.將發酵液12000 r/min 離心20 min 后,收集上清液并用0.22 μm 微孔濾膜過濾,進而獲得無菌發酵液.

1.5 菌株21-3 無菌發酵液對禾谷鐮刀菌的抑制作用

采用含毒介質法,將不同培養基培養獲得的無菌發酵液與加熱融化后并冷卻到50 ℃左右的PDA 培養基進行混合,分別按照體積比為1%、2%、4%及10%配制成含有不同梯度無菌發酵液的培養基.待培養基凝固后,在平板中心接入0.5 cm 大小禾谷鐮刀菌菌餅,以不加無菌發酵液的PDA 培養基為對照,25℃下培養3 d 后計算抑菌率.每個處理重復3 次.

1.6 菌株21-3 對不同植物病原真菌的拮抗作用

采用皿內對峙法,用滅菌牙簽挑取待測放線菌菌體于PDA 平板四點（距平板中心25 mm 處）,先在25 ℃下培養2 d,之后在平板中央接入0.5 cm 大小的不同植物病原真菌菌餅,25 ℃下培養5 d 后測量抑菌帶寬度（沿放線菌菌落與平板中心方向,放線菌菌落邊緣至真菌菌落邊緣的距離）.

2 結果與分析

2.1 菌株21-3 對禾谷鐮刀菌的抑制作用

菌株21-3 對禾谷鐮刀菌的抑制作用如圖1 所示.

圖1 菌株21-3 對禾谷鐮刀菌的抑制作用Fig.1 Strain 21-3 against F. graminearum on PDA plate

由圖1 皿內對峙結果可知,菌株21-3 的存在對禾谷鐮刀菌的菌落生長具有顯著的抑制作用.經計算,該菌株對禾谷鐮刀菌的抑菌率為69.9%±1.3%.從而說明菌株21-3 對禾谷鐮刀菌具有較好的拮抗能力.

2.2 菌株21-3 的鑒定

2.2.1 形態特征及生理生化特征鑒定 菌株21-3 在高氏1 號培養基上的形態特征如圖2 所示.

圖2 菌株21-3 在高氏1 號培養基上的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of the strain 21-3 on the Gause’s synthetic agar medium

由圖2 可知,在形態特征方面,菌株21-3 在高氏1 號培養基上生長7 d 后的菌落較小,邊緣整齊,氣生菌絲白色,基內菌絲黃色.顯微觀察發現,該菌株菌絲無隔膜,分支狀,孢絲螺旋狀排列.

菌株21-3 的生理生化特征見表1.

表1 菌株21-3 的生理生化特征Tab.1 Physio-biochemical characteristics of strain 21-3

由表1 菌株21-3 的生理生化特征可以看出,菌株21-3 能夠利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇;不能利用果糖、麥芽糖、阿拉伯糖,能夠水解淀粉、利用纖維素;不能使明膠液化、牛奶凝固,不產生黑色素和硫化氫.

根據以上特征,可初步將菌株21-3 鑒定為鏈霉菌.

2.2.2 分子鑒定 將菌株21-3 的16SrDNA 序列于GenBank 數據庫進行比對后,選擇相關菌株的16SrDNA序列,并采用鄰接法構建系統發育樹.基于16S rDNA 序列采用鄰接法構建的系統發育樹如圖3 所示.

圖3 基于16S rDNA 序列采用鄰接法構建的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

由圖3 可知,菌株21-3 與S.griseoflavusLMG 19344,以及S. griseorubens WZ903、BCCO 10_1270聚在一起,處于一個分支.結合形態學特征以及生理生化特征,最終將菌株21-3 鑒定為灰略紅鏈霉菌.

2.3 菌株21-3 無菌發酵液對禾谷鐮刀菌的抑制作用

為驗證菌株21-3 無菌發酵液對禾谷鐮刀菌的抑菌作用,并篩選出適合的培養基種類.分別利用4 種不同培養基對菌株21-3 進行發酵培養,并獲得相應的無菌發酵液.不同培養基獲得的菌株21-3 無菌發酵液對禾谷鐮刀菌的抑菌率如圖4 所示.

圖4 不同培養基獲得的菌株21-3 無菌發酵液對禾谷鐮刀菌的抑菌率Fig.4 Inhibition rate of strain 21-3 culture filtrate in different medium against F. graminearum

由圖4 可知,不同無菌發酵液對禾谷鐮刀菌的菌落生長都具有一定的抑制作用,但抑菌能力各不相同.在體積分數為10%時,YG 培養基和PDB 培養基獲得的無菌發酵液的抑菌作用最強,抑菌率都在40%以上.KMB 培養基與發酵培養基獲得的無菌發酵液的抑菌率相對較低.隨著發酵液濃度降低,抑菌率也逐漸下降.當體積分數為1%時,4 種培養基獲得的無菌發酵液的抑菌率都低于10%.由此說明,菌株21-3無菌發酵液中存在能夠抑制禾谷鐮刀菌菌落生長的代謝物質, 并且不同培養條件下產生的抑菌物質組分或活性存在差異.

2.4 菌株21-3 對不同植物病原真菌的拮抗作用

采用皿內對峙的方式驗證菌株21-3 對禾谷鐮刀菌以外的其他植物病原真菌的抑制作用結果見表2.

表2 菌株21-3 對不同植物病原真菌的拮抗作用Tab.2 Strain 21-3 against pathogenic fungi on PDA plate

由表2 可以看出,菌株21-3 對桃褐腐病原美澳型核果褐腐菌的抑制作用最強,抑菌帶寬為9 mm 左右.西瓜炭疽病病原瓜類炭疽病菌,抑菌帶為8 mm 左右.對玉米大斑病病原大斑凸臍蠕孢菌和小麥莖基腐病病原假禾谷鐮刀菌的抑菌帶都為6 mm 左右. 而對蘋果霉心病病原粉紅聚端孢菌的抑制能力最低,抑菌帶為4.8±0.5 mm.以上結果說明,菌株21-3 具有一定的抑菌譜.

3 結論與討論

鏈霉菌產生的抗生素可以抑制多種病原菌的生長,從而可以用于植物病害的生物防治[5].本研究從小麥根際土壤中分離到一株鏈霉菌21-3,該菌株對禾谷鐮刀菌具有較強的抑制作用.通過形態學特征、生理生化反應及16S rDNA 序列分析,將菌株21-3 鑒定為灰略紅鏈霉菌.菌株21-3 在4 種不同的培養基中培養后,所獲得的無菌發酵液都可以抑制禾谷鐮刀菌的菌落生長,但是抑菌效果存在差異.此外,菌株21-3 對瓜類炭疽病菌等5 種植物病原真菌表現出拮抗作用,從而說明該菌株具有防治多種植物病害的潛力.

研究表明,灰略紅鏈霉菌具有木質素降解的能力,從而有利于促進堆肥腐熟[12-13].在抑菌作用方面,灰略紅鏈霉菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等多種病原菌具有抑菌活性[14-17].此外,灰略紅鏈霉菌對于一些植物病原真菌也具有較強的抑制效果,如立枯絲核菌[18]、大麗輪枝菌[19]、尖孢鐮刀菌[20]等.本研究發現灰略紅鏈霉菌21-3 對禾谷鐮刀菌等多種植物病原真菌具有明顯的抑菌能力,但該菌株對小麥赤霉病的防病效果還需后續試驗研究.

朱本偉等[14]發現灰略紅鏈霉菌M506 在不同培養基中獲得的粗提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌均具有不同的抑制活性,由此推測該菌株在不同條件下產生的次級代謝物組分和活性均有不同.與此類似,本研究中的菌株21-3 在不同培養基中培養后,無菌發酵液所產生的抑菌作用也各有差異.在對灰略紅鏈霉菌抑菌機制方面的研究發現,菌株E44G 可以產生蛋白酶、幾丁質酶,進而對立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌起到抑制作用[18,20].菌株TRM11107 能夠產生拒霉素和特曲霉素,從而實現對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抗菌能力[17].所以,對菌株21-3 發酵條件、抑菌機理還需進一步研究.