氣相色譜法同時測定慕薩萊思中甲醇和乙醇的含量

陳勝慧子，侯曉杰，喬通通，蒲云峰，2，侯旭杰，2*

（1.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

慕薩萊思是具有新疆民族特色的傳統飲品，有近千年的歷史，傳承著新疆刀郎文化的精髓與靈魂[1]。慕薩萊思釀造工藝與現代和傳統葡萄酒釀造工藝存在著很大區別，其釀造過程一般為將新鮮葡萄（常用和田紅葡萄）洗凈、榨汁、熬煮濃縮后，經60 d左右自然發酵釀制而成[2-4]。根據個人口味及群體需求的不同，可以添加大蕓、白杏、桑椹、紅花、枸杞、鹿茸、紅棗、枸杞等中藥材[5]。慕薩萊思含有大量的醇類、糖類、有機酸、氨基酸等營養物質[6-7]，還含有原花青素、黃酮、花色苷、酚類等生物活性成分[8]。

近年來，隨著人們對傳統民族特色食品的青睞及消費市場需求的增加，慕薩萊思受到的關注也日益提升。目前，慕薩萊思的研究集中于釀造工藝優化[4]、菌種篩選及香氣形成機理方面的研究[3，9]，而甲醇和乙醇作為慕薩萊思中極為重要的產品品質指標和安全性指標，對其研究報道較少。慕薩萊思相關企業以及監管機構，對于能夠準確且同時測定甲醇和乙醇含量的方法的建立需求迫切。多位學者研究了葡萄酒、果酒等酒類中甲醇和乙醇含量的測定方法[10-11]，但通常僅限于單獨測定樣品中的甲醇或乙醇含量，鮮有建立同時測定甲醇和乙醇含量的方法。李惠明等[12]采用氣相色譜法同時測定了桑葚酒中的甲醇和乙醇含量，但該方法采用外標法。在前期的研究中發現，氣相色譜外標法的標準曲線線性關系差，結果不穩定。因此，建立一種簡單、快速、準確，并且能夠同時測定慕薩萊思中甲醇和乙醇含量的方法，對慕薩萊思以及其它酒類產品的質量和安全控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與樣品

無水乙醇（AR）：天津市致遠化學試劑有限公司；異丙醇、甲醇（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；樣品：市售31個不同廠家的慕薩萊思產品，分別用M1～M31表示31個不同的慕薩萊思酒樣。

1.2 試驗儀器

氣相色譜儀（GC-2014）[配有火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）]：日本島津公司；電子分析天平（EL204-IC）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

KB-PLOT Q（30 m × 0.32 mm，10 μm）毛細管柱，進樣口溫度：250℃，檢測器溫度：250℃，載氣為氮氣，流量 1.0 mL/min，進樣體積：1 μL，分流比為 50∶1，程序升溫：初始溫度為120℃，保持2 min，以10℃/min的速率升至170℃，保持3 min。

1.3.2 標準溶液配制

1.3.2.1 甲醇標準儲備液（5 000 mg/L）

參考GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》[13]中甲醇儲備液配制方法，略做修改。準確稱取0.5 g（精確至0.001 g）甲醇至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，混勻，4℃冰箱密封保存。

1.3.2.2 甲醇和乙醇混合標準工作液配制

參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》[14]和GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》[13]中標準溶液濃度范圍配制，取6個100 mL容量瓶，分別吸取2.00、3.00、4.00、5.00、7.00、14.00 mL 無水乙醇，然后分別吸取1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、20.00 mL 甲醇標準儲備液至容量瓶中，再用蒸餾水定容、混勻，現用現配。

1.3.3 標準曲線的制作

分別吸取10 mL甲醇和乙醇混合系列標準工作液于試管中，然后加入0.10 mL異丙醇，混勻，用0.22 μm針式濾膜過濾，測定甲醇、乙醇和內標異丙醇色譜峰面積，以甲醇濃度為橫坐標，以甲醇和異丙醇色譜峰面積的比值為縱坐標繪制甲醇標準曲線；以乙醇濃度為橫坐標，以乙醇和異丙醇色譜峰面積的比值為縱坐標繪制乙醇標準曲線。

1.3.4 慕薩萊思酒樣測定

吸取試樣10.0 mL于試管中，加入0.10 mL異丙醇，混勻，用0.22 μm針式濾膜過濾，注入氣相色譜儀中，以保留時間定性分析，同時記錄甲醇、乙醇和異丙醇色譜峰面積，再分別計算甲醇和異丙醇的色譜峰比值、乙醇和異丙醇的色譜峰比值，根據標準曲線分析慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量。

1.4 數據處理

采用SPSS20.0對所有試驗數據進行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan′s多重比較法分析，每個樣品重復3次，試驗結果表示為平均值±標準差，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 甲醇和乙醇的氣相色譜檢測結果

甲醇、乙醇混合標準品和慕薩萊思酒樣的色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 混合標準品的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of mixed standard

圖2 慕薩萊思酒樣的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of the Musalais sample

甲醇（峰1）、乙醇（峰2）和異丙醇（峰3）的保留時間分別為4.07、5.34、7.09 min，在該分析條件下，甲醇、乙醇和異丙醇色譜峰的分離度遠遠大于1.5，說明該條件適合慕薩萊思中甲醇和乙醇含量的測定。

2.2 標準曲線

參照1.3.1的色譜分析條件，以甲醇和乙醇峰面積與內標峰面積比值為縱坐標，甲醇和乙醇濃度為橫坐標繪制標準曲線，以濃度最小的標準溶液逐級稀釋，然后進樣分析，通過信噪比的計算獲得檢測限（limit of detection，LOD，S/N=3）和定量限（limit of quantitation， LOQ，S/N=10），具體結果見表1。

表1 甲醇和乙醇的標準曲線Table 1 Standard curves of methanol and ethanol

由表1可知，甲醇和乙醇標準曲線的相關系數（R2）分別為0.999 5和0.999 3，表明在試驗濃度范圍內的線性關系良好。從檢測限（LOD）和定量限（LOQ）分析，甲醇的檢測限和定量限為2.34 mg/L和7.02 mg/L，而GB5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》[13]中的檢測限和定量限分別為7.5mg/L和25mg/L[15]，說明該方法測定甲醇的檢測限和定量限遠低于國標要求，具有較高的靈敏度。李中賢等[16]采用氣相色譜內標法建立了單獨測定葡萄酒中甲醇含量的方法，其對甲醇的檢測限為7.20 mg/L，高于本方法中的檢出限。目前，尚無關于氣相色譜法測定乙醇的檢測限和定量限的相關報道，但從表1的結果可以看出，乙醇的檢測限和定量限也較低。上述研究結果表明，采用目前條件所建立的方法分析慕薩萊思酒中甲醇和乙醇含量，方法的檢測限低，靈敏度高，具有推廣使用的價值。

2.3 穩定性

通過預試驗，確定含有甲醇的慕薩萊思酒樣，隨機選取其中一個酒樣（M23）進行分析，參照1.3.4的方法進行制備樣品，采用0.22 μm針式濾膜過濾樣品，準備5份相同的樣品，分別在4℃的條件下放置0、6、12、18、24 h后進樣，然后計算平均值、標準差及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表2。

表2 穩定性試驗結果Table 2 Results of stability test

由表2可知，在24 h內測定酒樣中甲醇和乙醇含量的相對標準偏差分別為2.87%和1.79%，兩者的相對標準偏差（RSD）均＜5%，表明該分析條件下，樣品的穩定性較好，即在4℃的條件下放置24 h內，樣品測定結果穩定。

2.4 精密性

以穩定性試驗的慕薩萊思酒樣（M23）為研究對象，參照1.3.4的方法進行樣品制備，采用0.22 μm針式濾膜過濾樣品，平行進樣6次，記錄甲醇、乙醇和異丙醇的峰面積，然后計算慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的平均值和RSD，結果見表3。

表3 精密性試驗結果Table 3 Results of precision test

由表3可以看出，甲醇和乙醇的相對標準偏差分別為2.39%和1.71%，均小于5%，說明平行測定6次的結果誤差較小，該方法的精密性和準確性較高。

2.5 回收率

以穩定性和精密性試驗的酒樣（M23）為研究對象，準確移取50mL酒樣至100mL容量中，然后準確吸取一定量的1.3.2.1的甲醇標準儲備液，再準確吸取一定量的無水乙醇，混勻后用蒸餾水定容，參照1.3.4的方法進行樣品制備，采用0.22 μm針式濾膜過濾，每個處理重復6次，進樣分析，計算回收率，結果見表4。

表4 回收率試驗結果Table 4 Results of recovery test

由表4可以看出，甲醇、乙醇的回收率在93.18%～97.66%，回收率均超過90%，說明該方法分析慕薩萊思中甲醇、乙醇含量的回收率較好，可滿足樣品的定量分析需求，具備應用于實際生產的條件。

2.6 慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的測定

參照1.3.4的樣品制備方法制備樣品。然后按1.3.1的色譜條件進行分析，獲得慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的結果，結果見表5。

表5 慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的對比Table 5 Methyl alcohol and ethanol contents in Musalais liquor samples

續表5 慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的對比Continue table 5 Methyl alcohol and ethanol contents in Musalais liquor samples

通過對31個慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量分析可知，只有5個酒樣中檢測到甲醇，其中M7酒樣中的甲醇含量最高，達（428.17±10.25）mg/L，且超過葡萄酒中甲醇的限量標準，國標中規定白、桃紅葡萄酒中甲醇含量≤250 mg/L，紅葡萄酒≤400 mg/L[13]。而其余4個檢測到甲醇的酒樣中甲醇含量遠遠低于GB 15037—2006《葡萄酒》中規定的甲醇限量，說明絕大部分慕薩萊思酒樣中甲醇含量較低且符合國家標準。分析M7慕薩萊思酒樣中甲醇含量異常的原因，可能是由于M7樣品的原料中含有紅棗，而紅棗富含果膠和多糖，其在發酵過程中易產生過量的甲醇，進而導致M7酒樣甲醇含量異常[17-18]。也有多位學者研究指出在以紅棗為原料制備的發酵酒中甲醇含量較高，李堅等[19]采用新疆若羌紅棗為原料制備紅棗酒，其中甲醇的含量介于 336.95 mg/L～486.11 mg/L；黃孟陽[20]分析了紅棗酒發酵過程中甲醇含量的變化規律發現，在發酵過程中其甲醇含量最高可達601.70 mg/L，采用一系列措施對甲醇生成量進行減控后可降低至223.40 mg/L。這均表明紅棗作為原料生產發酵酒過程中，甲醇是其必然產物之一，因此極有必要建立簡單有效的方法對其進行檢測。從所測酒樣的乙醇含量分析可知，該批慕薩萊思酒樣的乙醇含量介于7.89%～14.55%，符合GB 15037—2006《葡萄酒》中乙醇含量要求（≥7%），但2/3的酒樣實際乙醇含量與標簽標識差異較大（＞0.5%），部分樣品的乙醇含量與標識含量差異超過2%，說明目前慕薩萊思生產企業在產品的乙醇含量測定方面存在的問題較為嚴重，有必要建議企業開展檢驗人員培訓或采用氣相色譜法測定產品的乙醇含量。

3 結論

本研究采用KB-PLOT Q毛細管柱，建立了氣相色譜法同時測定慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的方法，該方法與國標和文獻方法相比較，既具備同時測定慕薩萊思酒樣中的甲醇和乙醇含量，還具有樣品處理簡單、分析周期短、色譜峰分離度高、檢測限和定量限低、結果穩定等優勢，適用于慕薩萊思及其它果酒樣品中甲醇和乙醇含量的同時測定。從樣品分析結果來看，以葡萄為原料釀造的慕薩萊思的甲醇含量均符合GB 15037—2006《葡萄酒》中對甲醇含量的要求，但原料中含有紅棗時，甲醇含量可能會超標；從慕薩萊思中乙醇含量的測定結果分析，所有樣品均符合GB 15037—2006《葡萄酒》中乙醇含量要求，但實際測定結果與標簽標識乙醇含量差異較大，這可能是由于慕薩萊思屬于傳統民族特色食品，實現工業化生產的時間較晚，企業對產品質量指標的檢測方面重視程度不夠。因此，有必要在慕薩萊思生產企業開展氣相色譜法測定酒樣中甲醇和乙醇含量的相關培訓等工作，為促進新疆慕薩萊思產業的進一步發展助力。