ω-黑麥堿基因表達缺失的1BL/1RS易位系種質創新

張士昌，李亞青，張 楠，彭義峰，李孟軍

(石家莊市農林科學研究院/河北省小麥工程技術研究中心，河北石家莊 050041)

栽培黑麥(L.)是改善小麥重要性狀和豐富其遺傳多樣性的優良基因供體。黑麥1R染色體短臂(1RS)取代普通小麥1B染色體短臂(1BS)形成的1BL/1RS易位系具有黑麥1RS攜帶的抗葉銹、稈銹、條銹和白粉病等抗性基因，同時具有良好的豐產性和適應性。1980-2002年，中國小麥育成品種中，1BL/1RS易位系品種在全國主要麥區平均占比38%，其中北方冬麥區和黃淮冬麥區分布頻率分別為59%和42%，但因1BL/1RS易位系對加工品質具有負向效應，在優質強筋小麥品種中，1BL/1RS易位系比較罕見，只有鄭麥7698、煙農21等少數優質強筋小麥品種為1BL/1RS易位系。一般認為，1BL/1RS易位系加工品質低劣的主要原因有：(1)1BS上編碼低分子量麥谷蛋白亞基的位點和編碼γ-醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白的位點的喪失；(2)1RS上編碼40 K γ-黑麥堿和ω-黑麥堿的位點的導入。因此，改良1BL/1RS易位系加工品質的主要途徑包括：(1)在1RS末端導入和位點；(2)降低或沉默ω-黑麥堿基因位點的表達；(3)導入優質高分子量麥谷蛋白亞基。

1RS上位點編碼40K γ-黑麥堿和ω-黑麥堿，其中，ω-黑麥堿富含谷氨酰胺，幾乎不含有半胱氨酸，分子間和分子內無二硫鍵，可使面團吸水性增大，持水性、穩定性和延伸性降低，導致1BL/1RS易位系的烘烤和蒸煮品質下降。降低或沉默ω-黑麥堿基因表達的主要途徑包括：(1)利用部分同源染色體配對交換，通過易位使位點缺失；(2)采用反義RNA或RNA干擾技術降低甚至沉默ω-黑麥堿基因的表達；(3)利用輻射誘變技術使位點缺失，如利用快中子輻射創制的衡觀35的突變體。

冬小麥品種石麥15是石家莊市農林科學研究院小麥研究所選育的節水高產抗逆品種，但其加工品質表現不佳。為了發掘其在育種和生產中的利用價值，本研究利用N離子束誘變技術，采用醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺電泳方法(A-PAGE)驗證篩選ω-黑麥堿表達突變株系，創制了一系列ω-黑麥堿基因表達缺失且農藝性狀無顯著改變的新型1BL/1RS易位系，并對這些新種質的農藝性狀和品質性狀進行分析，以期為培育優質抗逆1BL/1RS易位系提供新的種質和思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

冬小麥品種石麥15 由石家莊市農林科學研究院小麥研究所提供。精選石麥15小麥種子以胚向上的方式擺放在靶盤中，靶盤放置在離子注入機(UIL.0.512，TNV，俄羅斯強電研究所)的真空靶室中(真空度3×10Pa)進行N束(荷能30 keV)注入，注入劑量分別為4×10N·cm和6×10N·cm。每個劑量重復3次，一次重復使用500粒種子。輻照后的小麥種子(M)點播種植，株距10 cm，行距30 cm，單株收獲后獲得M代。將M代種子按單株分行種植，株距10 cm，行距30 cm，每個株行隨機收獲10個單穗，單穗脫粒后獲得M代。M～M代種植方法與M代一樣，單株收獲。M代獲得ω-黑麥堿表達缺失突變穩定株系。將M代獲得的1BL/1RS易位系種子進行微區種植，全部收獲，用于農藝性狀觀察和品質分析。

1.2 方 法

1.2.1 ω-黑麥堿基因表達缺失突變體的篩選

ω-黑麥堿基因表達缺失突變體篩選采用A-PAGE技術，略有改動。每個M單穗隨機選取3粒種子，切取遠胚端約1/2粒，砸碎，加入100 μL提取液(50% 2-氯乙醇，0.05%甲基綠，20%甘油)，4 ℃提取過夜；12 000 rpm離心5 min，上清液即為醇溶蛋白電泳樣品。聚丙烯酰胺膠濃度為12%，交聯度為2.5%；恒壓300 V，電泳時間2 h。染色過夜，拍照記錄。

1.2.2 1RS染色體臂的分子標記檢測

采用植物基因組提取試劑盒(天根，北京)提取葉片DNA。引物AF1/AF4、O11B3/O11B5、Bmac0213、IAG95-1、SCSS30.2、IB-267的合成及PCR擴增程序參照文獻。PCR反應體系：2×Taq PCR StarMix(Genstar)10 μL，引物(10 μmol·L)各1 μL，模板DNA 50～100 ng，ddHO補充至20 μL。所有引物均由Invitrogen公司合成。引物O11B3/O11B5是1BS特異引物；引物AF1/AF4 、Bmac0213、 IAG95-1、SCSS30.2和IB-267是1RS特異引物。引物AF1/AF4在1RS上有多個結合位點；引物IAG95-1、SCSS30.2、IB-267結合位點在位點靠近1RS末端一側，為1RS末端抗病基因標記，可標示1RS末端的存在與否。引物Bmac0213結合位點在位點靠近著絲粒一側。這些引物可反映1RS的有無和缺失區段。

1.2.3 ω-黑麥堿基因表達缺失突變體的農藝性狀分析

ω-黑麥堿基因表達缺失突變株系采用隨機區組設計進行小區產量比較試驗。每個小區8行，行長10 m，行距0.15 m，3 次重復，基本苗300萬株·hm，其他管理同一般大田。產量及其構成因素按李雁鳴的方法進行。收獲前定點調查各小區穗數；連續取20穗，計算穗粒數；成熟期各小區全部收獲，曬干后稱重，計算千粒重和產量。數據分析采用DPS v3.0分析軟件進行。

1.2.4 ω-黑麥堿基因表達缺失突變體的品質性狀分析

ω-黑麥堿基因表達缺失突變體的品質性狀分析在石家莊市農林科學研究院品質分析實驗室進行。根據NY/T 1094-2006標準，采用MLU 202實驗磨制粉；根據GB/T 24899-2010標準，采用Perten 7200近紅外谷物品質分析儀測定蛋白質含量；根據GB/T 5506.2-2008標準，采用Perton 2200型面筋指數儀測定面粉濕面筋含量；根據GB/T14614-2006標準，采用Brabender 810110型粉質儀測定粉質參數。采用DPS v3.0分析軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 ω-黑麥堿基因表達缺失突變體的鑒定

A-PAGE電泳圖譜(圖1)顯示，1BL/1RS易位系石麥15 ω-醇溶蛋白具有1RS特征條帶，而9個突變株系無此特征條帶。這表明，獲得的突變株系為ω-黑麥堿基因表達缺失突變體(圖1A)。引物AF1/AF4和引物O11B3/O11B5 擴增結果表明，9個突變株系僅含有1RS(圖1B,C)。引物Bmac0213引物擴增結果表明，9個突變株系在標記Bmac0213位點附近缺失片段大小不同(圖1D)。引物IAG95-1、IB-267、SCSS30.2擴增結果顯示，9個突變株系1RS末端存在差異(圖1E,F,G)。

A：ω-醇溶蛋白A-PAGE電泳圖譜；B：引物AF1/AF4 PCR擴增結果；C：引物O11B3/O11B5擴增結果；D：引物Bmac0213 PCR擴增結果；E：引物IAG95-1 PCR擴增結果；F：引物IB-267 PCR擴增結果；G：引物SCSS30.2 PCR擴增結果；M：DNA Marker DL 2000 plus；1：石麥15；2～10：ω-黑麥堿基因表達缺失突變株系，分別為A05、A12、A19、A22、A45、A62、A77、A89和A95；11：師欒02-1；12：ddH2O。

2.2 ω-黑麥堿基因表達缺失突變體的農藝表現

從表1可以看出，9個ω-黑麥堿基因表達缺失突變株系的株高、穗數、穗粒數、千粒重和產量5個農藝性狀與石麥15均無顯著差異，這表明，ω-黑麥堿基因表達缺失對突變株系的農藝性狀沒有造成顯著影響。ω-黑麥堿基因表達缺失突變株系之間在株高上無顯著差異，但在穗數、穗粒數、千粒重和產量指標上，部分突變株系表現出顯著 差異。

表1 ω-黑麥堿表達缺失突變株系的農藝性狀Table 1 Agronomic traits of 1BL/1RS translocation lines with ω-secalin absence

2.3 ω-黑麥堿基因表達缺失突變體的加工品質

從表2可知，大部分ω-黑麥堿基因表達缺失突變株系的籽粒蛋白質含量、吸水率、濕面筋含量和面團穩定時間與石麥15均存在顯著差異，這表明，ω-黑麥堿基因表達缺失對突變株系的加工品質有顯著影響。面團穩定時間反映面團的耐揉性，是評價面粉品質優劣的重要指標。ω-黑麥堿基因表達缺失突變株系面團穩定時間為2.6～3.8 min，是石麥15的1.6～2.4倍，說明ω-黑麥堿基因表達缺失顯著改善了石麥15的面粉品質。

表2 ω-黑麥堿基因表達缺失突變株系的加工品質Table 2 Grain processing quality of 1BL/1RS translocation lines with ω-secalin gene absence

3 討 論

1BL/1RS易位系作為育種親本，在我國育成了一批具有影響力的小麥品種，如石4185、邯6172、矮抗58、鄭麥7698等，對于提高我國小麥抗病性、豐產性和穩產性發揮了重要作用。近年來，隨著人們生活水平的提高，對小麥產品的品質提出了更高的要求，而1BL/1RS易位系因其對小麥品質具有負向效應，導致其在小麥育種中的應用減少。為了既充分利用1BL/1RS易位系的豐產抗逆特性，同時又避免其加工品質缺陷，一些研究者利用突變體誘導部分同源重組、基因工程技術、輻射誘變、導入優質高分子量麥谷蛋白亞基等方法，對1BL/1RS易位系進行了改良，期望獲得豐產抗逆優質1BL/1RS易位系。

Martin等認為，1BL/1RS易位系面包品質不佳的主要原因在于1RS上位點編碼的黑麥堿，而不在于1BS編碼的低分子量麥谷蛋白和醇溶蛋白。因此，降低或沉默1RS上位點的表達是利用1BL/1RS易位系培育高產抗病優質小麥新品種的關鍵措施。Lukaszewski利用缺失突變體，通過誘導 1RS和 1BS 的部分同源重組的方法，已成功創制位點缺失的1BL/1RS易位系。晏本菊等利用不同的黑麥親本資源，獲得ω-黑麥堿基因缺失的1BL/1RS易位系。柴建芳等利用RNA干涉技術沉默了ω-黑麥堿基因的表達。以上這些途徑雖然都可以創制ω-黑麥堿基因表達缺失突變體，但這些方法在對1BL/1RS易位系小麥品種進行改良時，均存在著很大的局限性。

ω-黑麥堿由位點上ω-黑麥堿基因家族編碼，應用輻射誘變技術可以獲得ω-黑麥堿基因表達缺失突變體，如王道文課題組利用快中子輻射創制了衡觀35的突變體。1BL/1RS易位系石麥15是一個節水高產品種，但其加工品質不佳，對其推廣應用造成不利影響。本課題組利用N離子束誘變技術創制了石麥15突變體群體，經過連續田間和A-PAGE選擇獲得了ω-黑麥堿基因表達缺失的1BL/1RS易位系穩定株系。N離子束誘變對小麥農藝性狀具有不利影響，但經過田間對ω-黑麥堿基因表達缺失突變株系的農藝性狀進行多代選擇，克服了輻射誘變對農藝性狀的負向效應。雖然ω-黑麥堿基因表達缺失突變株系1RS上缺失片段大小不同以及部分突變株系1RS末端缺失，但其加工品質均得到了改良。目前，我們正在開展以下工作：(1)利用缺失突變體在1RS末端導入/位點；(2)利用分子標記技術，通過常規雜交導入優質高分子量麥谷蛋白亞基。我們期待通過以上工作進一步提高1BL/1RS易位系加工品質，創制出豐產抗逆優質1BL/1RS易位系。