玉米根毛單細胞類型轉錄組分析

王春霞， 王 晶， 曹子健， 胡 寶， 許子潔， 陳立群

(1.河北工程大學園林與生態工程學院，河北邯鄲 056038；2.中國農業大學生物學院植物生理學與生物化學國家重點實驗室，北京 100193)

根毛是從根表皮細胞特異性分化來的長管狀結構的單細胞，大約覆蓋根表面積的77%左右，根毛通過擴大根的吸收面積從而促進水分和礦質營養的吸收。同時根毛是豆類如大豆中根瘤菌與根瘤形成的第一接觸點，根毛還參與了病原體的防御。另外，根毛是典型的頂端生長的植物單細胞，是研究植物細胞極性生長發育、細胞分化很好的模式材料。

根毛的生長發育主要分為3個階段：第1階段為根毛細胞的命運決定；第2階段為根毛的起始生長；第3階段為根毛的頂端生長過程。根毛細胞的命運決定方式有3種不同類型，第1種類型是根表皮細胞隨機分化發育成根毛，玉米和大豆的根毛是這種分化類型；第2種類型是根表皮原細胞經過不均等的細胞分裂，產生的較小的細胞分化發育成根毛，水稻根毛是這種分化類型；第3種類型是根表皮細胞的分化方式是由2類細胞所處的位置決定的，這2種細胞分別為生毛細胞 (trichoblast，H cells) 與非生毛細胞 (atrichblast，N cells)，緊鄰2個皮層細胞的生毛細胞將來能夠分化發育成根毛，然而緊靠單個皮層細胞的非生毛細胞，是不能分化發育成根毛的，十字花科植物擬南芥的根毛是這種分化方式。

目前，關于模式植物擬南芥根毛生長發育分子機制的研究已經比較深入，由多個基因共同參與調控，其中()、()、()、()、()、() 和() 等基因參與根毛細胞的命運決定。其中基因是調控擬南芥根毛生長的關鍵基因，它編碼亮氨酸拉鏈型轉錄因子，負調控擬南芥根毛的生長，突變體中根毛的生長發生嚴重紊亂，非生毛細胞也可以分化發育成根毛?；虻谋磉_受到轉錄因子復合物WER-GL3-EGL3-TTG1和 CPC-GL3-EGL3-TTG1的調控。當根毛細胞的命運決定完成以后，根毛就進入快速的起始生長階段，在數10 min內即可完成該過程。目前的研究已經鑒定到多個基因參與調控根毛的起始生長，已知擬南芥() 基因編碼一種含DHHC-CRD結構域的錨蛋白，突變體根毛基部的直徑大小增加約30%。() 基因參與根毛細胞壁的合成。根毛的伸長生長是一種典型的頂端生長過程，根毛的頂端生長受到多種因素的協同調控，如Ca、囊泡、細胞骨架、小G蛋白、活性氧等。

目前，對模式植物擬南芥根毛的研究較深入，但是對玉米根毛生長發育機制的研究卻非常有限，僅報道了幾個基因，其中包括()、()、()、()及。玉米作為一種單子葉植物，其根系類型、表皮細胞分化為根毛的方式與十字花科植物擬南芥有所不同，因此推測玉米根毛生長發育與擬南芥也可能存在一些不同的調控機制。本研究以玉米根毛為研究對象，收集生長3 d的玉米B73根毛進行單細胞類型的轉錄組分析，篩選在玉米根毛中特異表達的基因，挖掘參與玉米根毛生長發育的關鍵基因，分析玉米根毛基因主要參與的代謝通路及生物學過程，旨在為深入研究玉米根毛生長發育分子機制提供重要的依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2019年在河北工程大學開展，試驗材料為玉米 (L.) 自交系B73。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理與收集 玉米種子用10%的NaClO溶液消毒8 min，然后用去離子水清洗 5～8 次。將玉米種子鋪在種子萌發培養紙上，然后將培養紙卷成筒狀，垂直放入去離子水中進行培養，培養條件為避光，28 ℃。一部分玉米種子在72 h后根長達到約 3～4 cm時，用剪刀剪下玉米根迅速放入液氮中進行冷凍，然后在液氮中用細胞刮 (Coring，3010) 輕輕迅速刮下玉米根毛，隨后將玉米根毛收集到50 mL離心管中，剝離根毛后剩下的玉米根也單獨收集到50 mL離心管中，在-80 ℃冰箱中保存。另一部分玉米種子繼續培養至6 d后，收集幼苗，存放于-80 ℃冰箱。每種試驗材料進行2個生物學重復測序分析。

1.2.2 RNA的提取及質量檢測 玉米組織RNA提取的步驟參照天根生物科技(北京)有限公司的RNAprep Pure Plant Kit (貨號：DP441) 進行操作。然后用 NanoDrop ND-2000 (NanoDrop，Wilmington，DE，美國)對RNA 的濃度與純度進行質控，再通過瓊脂糖電泳進行驗證。

1.2.3 RNA-seq文庫構建及轉錄組測序 植物總RNA提取完成后，首先進行mRNA的純化，具體操作步驟參考NEBNext? Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (貨號：7490S) 的說明書進行。mRNA的純化完成后，將mRNA反轉錄成cDNA，然后回收cDNA產物。接下來進行cDNA末端修復、加接頭及PCR擴增，最后再回收PCR產物，到此RNA-seq文庫已經制備好，然后送北京貝瑞和康生物技術有限公司進行轉錄組測序。

1.2.4 轉錄組數據分析 轉錄組測序得到的原始數據 (raw data) 經過去除接頭和低質量的數據后得到過濾后的數據 (clean data)，然后將clean data用TopHat2比對到玉米基因組中，基因的表達水平采用 reads per million (RPKM) 的方法進行計算，用R package edgeR進行差異表達基因 (DEGs) 分析，表達倍數變化至少是2倍且-value小于0.05的基因才被視作差異表達基因。用interProScan和blast2go進行Gene Ontology (GO) 富集分析。通過 Pearson correlation 計算樣品重復之間的轉錄組測序數據的相關性。

1.2.5 實時熒光定量PCR (qRT-PCR) 分析 以轉錄組測序使用的RNA為模板，反轉錄成cDNA，通過Primer5軟件設計引物，引物序列見表1。使用2×RealStar Green Power Mixture with ROX Ⅱ反應液，反應體系50 μL：cDNA模板1 μL，正向引物(10 μmol/L) 1 μL，反向引物(10 μmol/L) 1 μL，2×RealStar Green Power Mixture 25 μL，ROX Reference Dye (50×) 1 μL，去離子水 21 μL。在ABI 7500 Real-time PCR儀中按照以下程序進行反應，反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40個循環。

表1 qRT-PCR引物

1.2.5 玉米根毛中可變剪切的瓊脂糖凝膠電泳分析 以轉錄組測序使用的RNA為模板，反轉錄成cDNA，通過Primer5軟件設計基因和的引物，引物序列見表2。反應體系為20 μL：cDNA模板1 μL，正向引物(10 μmol/L) 1 μL，反向引物(10 μmol/L) 1 μL，2×PCR StarMix 10 μL，去離子水7 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環，72 ℃ 5 min，20 ℃保存。

表2 可變剪切引物

2 結果與分析

2.1 轉錄組數據產出

根毛是根表皮細胞分化生長出的具有管狀結構的單細胞，大約覆蓋根表面積的77%左右，對植物水分和礦質營養的吸收具有重要的作用。在 28 ℃ 黑暗條件下，玉米自交系B73的種子在萌發紙中培養3 d后，玉米根能長到 5～7 cm(圖1-A)，將玉米根快速剪下放入液氮中進行冷凍，然后用細胞刮輕輕迅速刮下初生根上的根毛(圖1-B)。分離出的根毛用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后，可以觀察到完整的細胞核(圖1-C)，說明可以用于后續的 RNA-seq 分析。

大量收集單細胞根毛后，提取根毛RNA，建立根毛RNA-seq文庫。同時以剝離根毛的初生根及生長6 d幼苗的地上部分為材料，同樣也提取RNA，分別建立初生根和幼苗RNA-seq文庫。首先從 5 μg 的總RNA中將mRNA分離純化出來，然后反轉錄為cDNA，進而經過末端修復，dA-Tailing加尾，加接頭及PCR擴增后構建好RNA-seq文庫。每個樣品設置2個生物學重復，共產生6個RNA-seq文庫。通過北京貝瑞和康生物技術有限公司的Illumina Hiseq2500平臺進行測序，共得到43.17 Gb數據，具體每個樣品的測序數據產出量見表3。轉錄組測序得到的原始數據 (raw data) 經過去除接頭和低質量的數據后，每個RNA-seq文庫得到約 20～40 million的125 bp的clean reads。大約 85% 的clean reads能夠比對到玉米基因組 (ZmB73_RefGen_v3)，共得到約23 000個基因。為檢測 RNA-seq數據的可靠性，首先檢測每個樣品的2個生物學重復之間的相關性，結果發現它們的皮爾森相關系數均在 0.98～0.99 之間，表明RNA-seq數據具有較高的可靠性，可以用于后續的分析。

表3 各個轉錄組文庫的RNA-seq數據量

2.2 玉米根毛特異表達基因

為了篩選在玉米根毛中特異表達的基因，用R package edgeR進行差異表達基因 (DEGs) 分析。根毛轉錄組數據與玉米初生根 (剝離根毛) 的轉錄組數據比較，發現2 768個基因 (RPKM≥1，Fold change≥2，FDR≤0.05) 在根毛中的表達水平升高。與6 d幼苗地上部分的轉錄組數據比較，發現 4 521個基因 (RPKM≥1，Fold change ≥2，FDR≤0.05) 在根毛中的表達量升高。同時與初生根 (剝離根毛) 及6 d幼苗的地上部分比較，分析得到 2 389 個在玉米根毛中特異表達的基因 (RPKM≥1，Fold change≥2，FDR≤0.05) (圖2-A)。為了進一步篩選在根毛中特異表達的基因，從NCBI SRA下載了玉米其他12種組織的轉錄組數據，與這12種組織的轉錄組數據進一步比較，篩選到1 050個基因 (RPKM≥1，Fold change≥2，FDR≤0.05) 在玉米根毛細胞中特異表達(圖2-B)。

2.3 玉米特異表達基因的qRT-PCR

為了驗證RNA-seq數據的可靠性，進一步從 1 050 個根毛特異表達基因中隨機挑選9個基因，分別為、、、、、、、和，用于檢測差異表達基因的準確性。qRT-PCR試驗所使用的RNA與用于 RNA-seq 分析的RNA是相同的。qRT-PCR結果顯示這9個基因的表達趨勢與RNA-seq數據基本符合(圖3)，證明分析得到的1 050個根毛特異表達基因是準確的?？梢杂糜诤罄m的研究。

2.4 玉米根毛特異表達基因的Gene Ontology (GO) 富集

為了研究根毛特異基因的功能及參與的生物學過程，使用FuncAssociate 3.0 (http：//llama.mshri.on.ca/funcassociate_client/html/) 對1 050個玉米根毛特異表達基因進行GO富集分析，結果發現這些根毛特異表達基因在細胞組分方面主要參與細胞壁的合成 (234個基因) 和細胞外部組分的組裝 (189個基因)；在分子功能方面主要參與離子結合 (615個基因)、氧化反應 (609個基因) 及鐵離子集合(550個基因)；在分子生物學過程方面主要參與氧化還原反應 (328個基因) 及應答氧化脅迫過程 (562個基因) (圖4)。已有的研究表明細胞壁組分、Ca及活性氧(ROS)對根毛的生長發育具有重要的作用，本研究的GO分析結果進一步說明了這些因素對根毛生長的重要性。

2.5 根毛發育基因同源性

目前，對擬南芥根毛生長發育機制的研究已經比較深入，發現許多基因參與調控擬南芥根毛的分化，起始生長和頂端生長。將1 050個玉米根毛特異表達基因與已知參與調控擬南芥和水稻根毛生長發育的基因進行同源比對，鑒定到23個同源基因(表4)，包括3個水稻基因。其中、()、()、、、、()、() 和() 基因參與根毛細胞壁的合成。、、和() 基因編碼bHLH家族轉錄因子，參與調控根毛的伸長生長。()、() 和() 基因可能通過細胞骨架來影響根毛的生長。()()、和基因編碼鳥苷酸交換因子，()基因編碼RhoGDP解離抑制因子，它們可能通過調節ROP蛋白的活性參與根毛的生長。SEC6是Exocyst蛋白的一個亞基，Exocyst蛋白參與胞吐過程，囊泡運輸對根毛的生長同樣具有重要的作用。

表4 玉米根毛特異表達基因的同源基因

對這23個基因的組織表達水平進行分析，從圖5可以看出，這些基因在玉米根毛中的表達水平高于其他組織。上述分析結果暗示，這些玉米根毛特異表達基因可能與它們在擬南芥或水稻中的同源基因一樣在根毛的生長發育過程中起到重要作用，并且它們的功能在物種間是保守的。

2.6 玉米根毛中特異表達轉錄因子

轉錄因子能夠與下游調控的靶基因啟動子區域中順式作用元件結合，進而抑制或激活靶基因的表達。對1 050個玉米根毛特異表達基因進行功能注釋，篩選到68個轉錄因子，這些轉錄因子可以被劃分到19個家族，其中屬于WRKY家族、bHLH家族及ERF家族的轉錄因子數量最多，包括14個WRKY家族轉錄因子、12個bHLH家族轉錄因子及8個ERF家族轉錄因子(表5)。已知bHLH家族中的LRL轉錄因子參與調控根毛的生長發育，擬南芥中的5個LRL轉錄因子都參與調控根毛的生長發育；擬南芥中WRKY75轉錄因子通過抑制() 和基因的表達來調控根毛的生長。推測玉米根毛中這些轉錄因子可能也參與調控玉米根毛的生長發育。

表5 玉米根毛特異表達基因中的轉錄因子

2.7 玉米根毛中的可變剪切

可變剪切是調節基因表達和產生蛋白質組多樣性的重要機制，是導致真核生物基因和蛋白質數量較大差異的重要原因。使用Trimmomatic V0.32軟件去除通用接頭，同時截去堿基質量低于30的reads。再用Tophat2將過濾后的reads比對到參考基因組 (ZmB73_RefGen_v3)，選擇唯一比對位置的reads進行下一步分析。用Diffsplice識別可變剪接事件，根毛與不同組織進行比較，選擇-value<0.01的可變剪切事件，作為2個組織不同的差異剪切事件。為了減小偏差，存在非典型剪切位點的轉錄本和表達豐度較低的轉錄本被移除，另外比對到非已知基因區域的轉錄本也被移除。最終，玉米根毛RNA-seq數據分析的結果表明，根毛細胞中存在內含子保留這一可變剪切形式 (圖6-A)。

進一步通過PCR試驗證明，根毛中存在內含子保留這一可變剪切形式，分別用引物擴增基因和的CDS序列，結果顯示在根毛中擴增的CDS序列顯著大于根與地上部分擴增的CDS序列，進一步證明了根毛中內含子保留的存在 (圖6-B)。

3 結論與討論

玉米是一種單子葉植物，其根系類型、根毛細胞分化方式等與擬南芥和水稻存在差異，因此推測玉米根毛生長發育可能存在一些不同的調控機制，并且目前對玉米根毛生長發育的研究也非常有限，只報道了幾個基因參與玉米根毛的生長發育，因此對玉米根毛的發育調控機制進行深入研究很有必要。

轉錄組測序能夠從整體水平研究基因表達量以及基因結構，揭示特定生物學過程中的分子機制。通常轉錄組測序的研究對象是某種組織的多種細胞轉錄出來的mRNA，得到的是多種細胞中信號的平均值。然而單細胞類型轉錄組測序的研究對象是某種特定細胞的轉錄信息，獲得的基因表達水平更加精確。筆者研究分析了生長3 d的玉米自交系B73根毛單細胞類型的轉錄組數據，篩選到1 050個在根毛中顯著高表達的基因。同時與Hey等發表的玉米根毛轉錄數據相比較，發現有1 604個基因是相同的，進一步說明筆者根毛轉錄組數據的準確性，因此，該結果可以為玉米根毛發育分子機制的研究提供非常重要的理論指導。

本研究大量收集生長3 d的玉米自交系B73的根毛，提取根毛RNA，建立RNA-seq文庫，進行玉米根毛單細胞類型的轉錄組分析。通過Illumina Hiseq2500平臺進行測序，共得到43.17 Gb數據，每個RNA-seq文庫得到約 20～40 million的clean reads。大約85%的clean reads能夠比對到玉米基因組 (ZmB73_RefGen_v3)，一共得到約23 000個基因。用R package edgeR進行差異表達基因 (DEGs) 分析，鑒定到1 050個基因在玉米根毛特異表達。使用FuncAssociate 3.0對1 050個玉米根毛特異表達基因進行GO富集分析，結果發現這些根毛特異表達基因在細胞組分方面主要參與細胞壁的合成，在分子功能方面主要參與氧化反應及鐵離子結合，在分子生物學過程方面主要參與氧化還原反應及應答氧化脅迫過程。細胞壁在根毛的生長過程中發揮了關鍵作用，其中纖維素是細胞壁的主要組成成分，擬南芥中的() 基因同樣編碼一種類纖維素合酶，在根毛中的表達量很高，突變體細胞壁中纖維素和木葡聚糖的分布發生紊亂，根毛在剛形成時就發生破裂。() 基因同樣編碼一種類纖維素合酶，在根毛中的表達量也較高，突變體根毛生長出較小的一部分后就發生破裂。鈣離子也是影響根毛生長發育的關鍵因素之一，Molendijk等研究發現，擬南芥中的小G蛋白 RHO-LIKE GTP BINDING PROTEIN 4 (ROP4) 和RHO-RELATED PROTEIN FROM PLANTS 6 (ROP6) 功能缺失，破壞了正在進行頂端生長的根毛細胞中的鈣離子濃度梯度，導致鈣離子濃度梯度消失，進而影響了根毛的頂端生長，根毛形態變得腫脹膨大?；钚匝跏巧矬w在有氧代謝過程中NADPH氧化酶 (NOXs) 利用氧氣作為電子供體產生的一種副產物，活性氧在根毛的生長發育過程中發揮了重要的調節作用，研究發現擬南芥中的() 基因同樣編碼一種NADPH氧化酶，能將電子從NADPH轉移到電子受體，從而形成活性氧，突變體具有根毛短小的表型。

轉錄因子 (transcription factor，簡稱TF)能夠與下游調控的靶基因啟動子區域中的順式作用元件結合，進而調控靶基因的表達，轉錄因子在根毛的生長發育過程中發揮重要的作用。對1 050個玉米根毛特異表達基因進行功能注釋，篩選到68個轉錄因子，這些轉錄因子被劃分到19個家族，其中WRKY家族、bHLH家族及ERF家族的轉錄因子數量最多。WRKY轉錄因子是植物所特有的一類轉錄因子，也是最大的一類轉錄因子。WRKY 轉錄因子因為N末端具有保守的WRKYGQK序列和鋅指結構而命名。擬南芥中() 基因編碼WRKY44轉錄因子，TTG2轉錄因子能直接調控表達，突變體根毛的生長發生異常。從低等植物到高等植物，bHLH家族轉錄因子均參與了根毛的生長發育。低等植物小立碗蘚 () 中的PpLRL1和PpLRL2轉錄因子在假根的生長發育過程中發揮了重要的作用。和單突變體假根的數量減少，約為野生型的40%左右，假根的長度也比野生型短，雙突變體假根的表型加重，無假根生成。擬南芥bHLH家族中的5個轉錄因子：AtLRL1～AtLRL5，都參與調控根毛的生長發育。

本研究通過對玉米根毛進行單細胞類型的轉錄組分析，鑒定到1 050個基因在玉米根毛中特異表達，這些根毛特異表達基因中包含68個轉錄因子，分析結果還顯示，根毛細胞中存在內含子保留這一可變剪切形式。該研究結果能夠為后續挖掘與玉米根毛生長發育相關的候選基因提供重要的數據支撐。