桑葚、百香果、柚子及火龍果復合果汁協同抑制α-葡萄糖苷酶的作用及機制

董宇豪，陳春，扶雄

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640）

隨著人們生活水平的提高，飲食結構發生了重大的改變，健康飲食的意識日益增強。天然果汁，以水果為原料，含有多酚、黃酮類、多糖、維生素等營養元素，具有豐富的營養價值，越來越受到大眾的青睞。桑葚（Fructus mori），天然活性物質含量豐富，在中醫臨床中，桑葚可以用于預防和治療各種慢性疾病，是一種藥食同源類食品[1]。百香果（Passiflora edulisSims），廣泛種植于熱帶地區，具有獨特的香味，常被應用于果汁、食品的調味增香，并且在抗氧化、降血糖等方面具有潛在應用價值[2]。柚子（Citrus grandis(L.)Osbeck），與其他水果相比，具有產汁量高的特點，最大產汁量可達果實重量的 40%～50%[3]?；瘕埞℉ylocereus），廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區，含有豐富的多酚、膳食纖維及鉀元素，具有潛在的抗氧化、抗炎、抗肥胖等作用[4]。然而，以上四種水果制備的單一果汁均存在一定的局限性，如桑葚的市售價格較高，百香果的出汁率較低，柚子的活性物質含量相對低，而火龍果制得果汁的風味較差等。因此，將其復配制備復合果汁可以充分發揮各自的優勢，并在一定程度上改善其應用上的局限，同時提高果汁的營養價值，豐富口感。

然而，目前對于復合果汁的大量研究都集中于口感、穩定性、理化性質的改善等方面[5，6]，針對果汁復配對于生物活性的協同增效作用及其作用機制的研究鮮見報道。協同作用存在于一些臨床藥物、天然產物之間，通過比較復合前后的活性強弱并計算組分之間的聯合指數，判斷是否具有增效作用，并區分疊加與協同作用，評價協同作用的強弱[7]。除此之外，通過抑制動力學的研究，繪制Lineweaver-Burk方程曲線，根據擬合方程的交點判斷抑制類型，并計算抑制常數以判斷抑制作用大小，從而深入探究作用機制。在余娜[8]的研究中發現，黃岑素與1-脫氧野尻霉素（1-DNJ）聯用后對淀粉酶的抑制活性增強，聯合指數計算結果表現為協同作用，且兩個抑制劑與酶作用位點不同，解釋了抑制活性增強的主要原因。

鑒于此，本文以桑葚、百香果、柚子、火龍果為原料，制備復合果汁并評價其抗氧化、降血糖活性，分析不同復合果汁組體系中的協同作用，并通過研究各單一果汁對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學，判定各自的抑制類型及抑制作用強弱，以期為復合果汁生物活性協同增效的研究與應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用桑葚、百香果、紅肉蜜柚、紅肉火龍果購于廣東省廣州市番禺區農貿市場，果實新鮮、完整且無機械損傷及病蟲害；福林酚試劑購于上海麥克林公司；沒食子酸購于上海阿拉丁公司；Trolox、熒光素鈉、APPH、α-葡萄糖苷酶及pPNG 購于美國 Sigma公司；Na2CO3購于廣州化學試劑廠。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Milli-Q Academic超純水系統（A10），Millipore公司；AHYQ數顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；XW-80A微型漩渦混合儀，上海精科實業有限公司；SpectraMax i3多功能酶標儀，美國 Molecular Devices公司；Varioskam Flash熒光酶標儀，美國Thermo Fisher公司；BY-1000B臺式離心機，北京白洋醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復合果汁的制備

首先，按照以下工藝流程制備桑葚、百香果、柚子、火龍果四種水果的單一果汁樣品。

得到單一果汁樣品后，測定單一果汁總酚含量，并根據單位體積的多酚含量等比例復配制備復合果汁，使復合果汁體系中各組分的多酚含量相同。

1.3.2 四種單一果汁多酚含量測定

各果汁樣品的多酚含量根據福林酚比色法測定[9]。以0～100 μg/mL沒食子酸（GAE）為標準參照物繪制標準曲線。具體步驟為：0.5 mL樣品或GAE與0.5 mL福林酚試劑混合，震蕩搖勻充分混合后在室溫下反應5 min，后加入0.75 mL NaCO3（20%，m/V）及3.75 mL去離子水，37 ℃下反應20 min，最后在760 nm下測定吸光值。為避免樣品顏色干擾，取相同體積的去離子水代替福林酚試劑作為對照。每組樣品設立三組平行試驗，結果以沒食子酸當量（mg GAE/mL果汁）表示。

1.3.3 果汁樣品氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）評價

樣品ORAC值的測定參照Zhang[10]的方法并加以改進。具體來說，于96孔黑色酶標板中依次加入20 μL不同濃度的樣品溶液或Trolox標準溶液（6.25、1.5、25、50 和100 μmol/L），后加入 200 μL 熒光素鈉溶液（95.6 nmol/L），在熒光酶標儀中自動混勻并于37 ℃下孵育10 min。隨后，加入20 μL AAPH溶液（119.4 mmol/L）并混勻，酶標儀記錄熒光強度（4 min/次，35次；激發波長：485 nm，吸收波長：535 nm），反應體系始終維持在37 ℃。根據不同濃度的Trolox標準溶液（6.25～100 μmol/L）的熒光猝滅面積（AUC）繪制標準曲線。每組樣品設立三組平行試驗。結果以每毫升果汁或每毫克沒食子酸的mmol Trolox當量表示（mmol TE/mL或mmol TE/mg GAE）。

1.3.4 果汁樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定

根據 Chen[11]的方法測定樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。果汁樣品溶液、α-葡萄糖苷酶（0.1 U/mL）和4-硝基酚-α-D-呋喃葡萄糖苷（pPNG，1.5 mmol/L）溶液的配制均使用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.9）。先將 50 μL 果汁樣品溶液與 100 μLα-葡萄糖苷酶充分混合，37 ℃下孵育10 min后，向混合液中加入100 μL底物溶液pPNG，充分混勻后，繼續在 37 ℃下孵育20 min，最后加入1 mL Na2CO3（1 mol/L）溶液以終止反應。測定反應液405 nm處的吸光度。樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率通過（1）式計算，并通過計算各樣品對α-葡萄糖苷酶抑制的IC50值表示抑制強度，以判斷降血糖活性。

式中：

As——樣品組吸光度；

Ab——緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶的背景對照組吸光度；

An——緩沖溶液代替樣品溶液的空白對照組吸光度。

1.3.5 果汁復合的聯合指數

參照 Chou等人[12]的方法，通過計算聯合指數（Combination Index，CI）評價協同作用?；诘刃ё饔煤椭兄刀ɡ碛嬎鉉I值，計算公式如下：

式中：

D1、D2——兩種組分聯合作用時，抑制率為 50%的每個組分各自的作用濃度；

(Dx)1、(Dx)2——兩種組分單獨作用時，抑制率為50%的作用濃度。

1.3.6 果汁對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學評價

抑制動力學主要研究活性物質對酶的抑制類型，并通過酶的失活過程判定活性物質的抑制程度。配制不同濃度的果汁樣品及不同濃度的底物溶液（1～4 mmol/L），α-葡萄糖苷酶的濃度為0.1 U/mL。測定不同反應時間下的樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率并計算反應速率。將結果帶入酶動力學方程進行擬合，分別以底物濃度倒數（1/[S]）及反應速度倒數（1/V）為橫坐標和縱坐標繪制 Lineweaver-Burk方程，繪制曲線并根據交點判斷抑制類型，進一步分析果汁復合的協同增效作用，并計算抑制常數（Ki），判定各果汁樣品對酶的抑制強度。

1.3.7 數據統計

每組試驗重復三次，數據結果以平均值±標準差（mean±SD）形式表示，顯著性水平為0.05。采用SPSS 25軟件進行數據分析，Origin 9.1軟件作圖，抑制動力學數據分析由GraphPad Prism軟件進行。

2 結果與分析

2.1 果汁中多酚含量比較

測定四種果汁的總酚含量，結果如表1所示。以mg GAE/mL果汁為單位，比較四種果汁總酚含量，由此可見，四種果汁總酚含量大小依次為桑葚＞百香果＞火龍果＞柚子，其中桑葚果汁的總酚含量為14.12±0.53 mg GAE/mL，顯著高于其他三種果汁。

表1 單一果汁樣品的總酚含量Table 1 TPC values of samples

2.2 果汁的抗氧化活性評價

ORAC法是根據自由基破壞熒光探針引起熒光強度變化的原理，在抗氧化劑存在時，可以抑制由自由基引起的熒光變化，程度可以反映其抗氧化能力。相較傳統的評價抗氧化活性的化學方法（如DPPH法及ABTS法）更加靈敏和準確，是目前應為最廣泛的體外評價抗氧化活性的方法之一[13]。因此，通過測定果汁樣品的ORAC值，比較樣品間的抗氧化活性。

結果如表2所示，當四種單一果汁的ORAC值以mmol TE/mL果汁為單位表示時，每單位體積果汁樣品的抗氧化活性比較為：桑葚＞百香果＞火龍果＞柚子，其中，以桑葚果汁最高為43.44 mmol TE/mL，結合四種果汁的總酚含量，可見，當二者均以每單位體積果汁樣品比較時，果汁的總酚含量與抗氧化活性呈現正相關性，果汁中多酚含量越高，則表現出更強的抗氧化活性。這說明在果汁樣品的抗氧化活性中，酚類物質起到了關鍵作用。這與其他已報道的研究結果具有一致性，在吳國美[14]的研究中發現，漿果果汁的抗氧化能力與其花色苷含量有較高的相關性；同樣，在對于8種水果果皮和果肉的酚類及抗氧化活性研究中發現，酚類物質含量與DPPH自由基清除能力及氧自由基吸收能力具有相關性[15]。

表2 單一及復合果汁的抗氧化活性Table 2 The antioxidant activities of samples

考慮到復合果汁的制備是以多酚含量等比例混合而得，因此，以mmol TE/mg GAE為單位，比較果汁樣品的抗氧化活性。由表2可見，對于單一果汁，每單位多酚含量的果汁樣品的抗氧化活性比較為：桑葚＞火龍果＞柚子＞百香果，其中，桑葚果汁樣品表現出最好的抗氧化活性，ORAC數值為3.08 mmol TE/mg GAE。與上述結論相比，不同單位下ORAC數值的比較結果略有不同，這主要是由于在不同單位表示下，ORAC數值分別表現為果汁體系抗氧化活性（以mmol TE/mL果汁為單位）及果汁內酚類物質單體抗氧化活性（以mmol TE/mg GAE為單位），在兩種比較方式下，桑葚果汁均表現出較好的抗氧化活性，由此可見，桑葚果汁體系及其酚類物質單體均具有較強的抗氧化活性，而火龍果果汁內可能含有較高抗氧化活性的酚類物質單體，該結論可為具有抗氧化活性的果汁的開發與利用提供借鑒。復合果汁的抗氧化活性結果如表2所示，其中，以四種果汁復合C4組ORAC值最高為3.87 mmol TE/mg GAE，三種果汁復合的組別中，以C1組ORAC值最高為3.19 mmol TE/mg GAE，略高于單一果汁的ORAC值，而C2和C3組的ORAC值低于桑葚果汁樣品，由此可見，果汁復合對于其抗氧化能力無明顯的增強效果。

2.3 果汁的降血糖活性評價

α-葡萄糖苷酶是人體體內關鍵的淀粉消化酶之一，通過水解低聚糖的α-1，4糖苷鍵生成葡萄糖發揮作用。因此，活性物質通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以緩解葡萄糖的釋放速度，調節餐后血糖，從而提高胰島素敏感性[16]。測定各樣品在不同濃度梯度下對于α-葡萄糖苷酶的抑制率，并計算IC50值，以比較不同果汁樣品的降血糖活性，結果如圖2及表3所示。

由圖2可見，隨著果汁濃度的升高，樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用逐漸增強。通過比較各樣品的IC50值（表3），單一果汁對α-葡萄糖苷酶 IC50值在0.30～0.49 mg GAE/mL之間，其中以桑葚果汁最低（0.30 mg GAE/mL），各果汁樣品對于α-葡萄糖苷酶的抑制作用比較為：桑葚＞百香果＞火龍果＞柚子，該結果與上述總酚含量（2.1）及抗氧化活性（2.2）一致，說明三者可能具有一定的相關性。桑葚果汁在抗氧化及降血糖兩個方面均表現出較高的活性，這可能與其豐富的生物活性物質（包括多酚、花青素、黃酮類化合物、多糖等）有關，在Chen等[17]的研究中表明，桑葚提取物可以降低糖尿病小鼠空腹血糖，改善體內抗氧化系統，修復器官組織損傷，同時，增加了小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性。

表3 單一及復合果汁的降血糖活性比較Table 3 The hypoglycemic activities of samples

對于復合果汁樣品，樣品對α-葡萄糖苷酶IC50值在 0.16～0.25 mg GAE/mL之間，均小于單一果汁的IC50值，即可初步判斷果汁復合對于樣品的降血糖作用具有一定程度的增強作用，降血糖作用樣品間比較為：C4＞C1＞C3＞C2，以C4組（IC50=0.16 mg GAE/mL）效果最佳，該結果與抗氧化活性一致。

2.4 復合果汁的協同作用評價

為進一步判斷果汁復配是否具有協同效應，研究復合果汁中單一組分及復配組分的劑量與效應關系，根據樣品濃度和IC50值計算CI指數。CI指數是基于質量作用定律提出的定量評價藥物相互作用效果的指標[18]。當CI＜0.9時，兩組分之間表現為協同作用，當 CI=0.9～1.1，組分間為疊加作用，當 CI＞1.1時，組分間表現為拮抗作用。通過上述樣品對α-葡萄糖苷酶 IC50值分別計算四種果汁復合時百香果、柚子及火龍果與其他三組復合果汁的CI值，評定各單一組分在復合體系中的協同作用，結果如表4所示。三組聯合指數均小于0.9，說明這三種單一果汁成分在桑葚-百香果-柚子-火龍果復合果汁體系中均表現出與其他三個組分的協同作用，而非簡單疊加。其中，柚子與桑葚-百香果-火龍果協同比較的 CI值最低為0.57，表明柚子對于體系發揮協同作用具有重要作用。該結果進一步證實果汁復合對于增強α-葡萄糖苷酶抑制活性具有協同作用的結果。在李俊萱[19]對于蘋果-漿果復合果汁的研究中得到相似結果，研究發現，與單一果汁相比，復配對果汁的生物活性具有一定的協同增效作用。

表4 果汁樣品聯合抑制50% α-葡萄糖苷酶活性時的聯合指數（CI）Table 4 The combination index (CI) values for the compound juice at the 50% inhibition of α-glucosidase activity

2.5 果汁對α-葡萄糖苷酶的抑制類型分析

為進一步驗證上述結果，對各果汁樣品進行酶抑制動力學的研究，分析樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制效果及類型。四種果汁樣品的 Lineweaver-Burk方程如圖3所示，樣品的雙倒數作圖均表現出良好的線性關系，其中，不同濃度桑葚果汁的擬合曲線相交于x軸，表現為非競爭型抑制類型，而其他三種果汁的擬合曲線均相交于第二象限，符合混合型抑制類型。在非競爭型抑制中，抑制劑結合在酶的非活性位點，不直接影響酶和底物的結合能力，而非競爭型抑制類型為抑制劑之間發揮協同抑制作用的基礎[20]。本試驗研究的四種樣品表現出非競爭型抑制和混合型抑制，說明其復配后對于體系的協同效果具有積極作用，該結論進一步驗證了上述協同抑制評價的結果。

由表5可見，依據Lineweaver-Burk動力學方程計算可得，四種果汁樣品在不同濃度下的最大反應速度值均隨濃度的升高而降低。抑制常數（Ki）為50%的酶與抑制劑結合時對應的抑制劑的濃度，反映的是抑制劑的抑制強度，Ki值越小說明抑制能力越強[21]。通過計算，四種果汁的 Ki值以桑葚最低為 22.2 mg/mL，說明桑葚果汁具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制作用排序為桑葚＞百香果＞火龍果＞柚子，該結果與上述結論一致。通過抑制動力學的試驗，在結合位點的角度進一步證實了果汁復配對于α-葡萄糖苷酶的抑制效果的協同增效作用。

表5 果汁樣品與α-葡萄糖苷酶作用的抑制動力參數Table 5 Kinetic parameters of α-glucosidase inhibition in the presence of juice

3 結論

本文制備了桑葚、百香果、柚子、火龍果果汁，研究果汁復配的協同抗氧化及降血糖作用，結果顯示：

（1）果汁復配對于果汁α-葡萄糖苷酶抑制作用的增強具有明顯效果，其中以四種果汁復配組具有最強的抑制作用，IC50值為0.16 mg GAE/mL。

（2）通過計算復配體系中的聯合指數，CI指數在0.57～0.70之間，均小于0.9，表現出協同增效作用。其中，以柚子與桑葚-百香果-火龍果協同的數值最低（0.57），表明柚子對復配體系α-葡萄糖苷酶抑制作用的增強發揮重要作用。

（3）通過抑制動力學進一步探究作用機制，結果表明，四種組分在體系中均沒有表現出競爭型抑制，證實了果汁復配的協同作用；而抑制常數計算結果顯示，相較于其他三種組分，桑葚果汁Ki值最低為22.2 mg/mL，表現出較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。