不同粒徑輪胎微塑料對大型溞的慢性毒性研究

王寧，王梅，徐晨馨，許心怡，譚巧國，羅專溪,*

1. 華僑大學化工學院，廈門 361021 2. 廈門大學環境與生態學院，廈門 361102

微塑料是指尺寸<5 mm的塑料或合成橡膠顆粒、碎片及纖維等。輪胎微塑料是環境中微塑料的重要來源之一[1-2]，廣泛分布于水、大氣和土壤等環境介質中[3]。研究發現，常見地表水中輪胎微塑料的濃度為0.09～10 mg·L-1[3]，而河流沉積物中的濃度高達400～2 200 mg·kg-1[4]。輪胎微塑料的化學性質穩定、難降解、粒徑小且分布范圍廣，可在環境中持久存在，并吸附多種污染物，具有較高的生態風險。

輪胎微塑料對水生生物具有一定的毒性效應[4-6]。Wik等[5]研究了輪胎微塑料浸出液對月牙藻(72 h生長抑制率)、大型溞(24～48 h死亡率)、網紋溞(48 h存活率，9 d繁殖率和存活率)以及斑馬魚胚胎(48 h致死率)的毒性，發現浸出物對網紋溞的9 d繁殖率影響最為顯著，對應的半數效應濃度(EC50)值為10 mg·L-1，該濃度與路面徑流中輪胎微塑料的預測濃度接近。Marwood等[6]發現溫度是影響輪胎微塑料浸出液毒性的重要因素，在21 ℃時，浸出液對月牙藻(72 h生長抑制率)、大型溞(48 h存活率)和鰷魚(48 h存活率)的EC50或半數致死濃度(LC50)值均>10 g·L-1，而當溫度升高至44 ℃時，浸出液對大型溞的LC50值降低至5 g·L-1。以上研究均是用輪胎微塑料浸出液進行的短期急性毒性測試，所使用的輪胎微塑料濃度也比實際環境中的濃度高出多個數量級。與以上實驗室暴露不同，真實水環境中的輪胎微塑料暴露是直接、低劑量而長時間的，其毒性效應尚不明晰。因此，開展輪胎微塑料對水生生物的毒性研究，尤其是環境濃度下的慢性毒性研究，對評估其生態風險具有重要意義。

本文以不同粒徑的輪胎微塑料為研究對象，使用大型溞作為受試模式生物，研究輪胎微塑料對大型溞的死亡率、蛻皮頻率和繁殖力的影響，并通過測定大型溞體內各種金屬的含量，以及蛋白質/脂肪來初步探究輪胎微塑料的慢性毒性機理，以期為正確評估輪胎微塑料生態風險提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料及生物

實驗使用的輪胎微塑料為實驗室自制；將廢棄汽車輪胎剪碎后放入研磨機(Tube Mill control，廣州艾卡儀器公司，中國)中反復研磨，研磨粉末依次過100目、150目和200目篩濕篩，收集過篩后不同粒徑范圍的輪胎微塑料。

受試生物大型溞(Daphniamagna)培養于光照培養箱(HP1500G型，武漢瑞華儀器，中國)中，培養溫度為22 ℃，光暗周期為14 h/10 h，培養用水為脫氯自來水，并每日喂食斜生柵藻。毒性測試開始前，將待產的母溞分離培養，次日即可獲得日齡<1 d的幼溞用于實驗。

1.2 研究方法

1.2.1 輪胎微塑料的物理化學性質表征

對制備好的輪胎微塑料顆粒進行顆粒密度、形貌與粒徑以及重金屬含量等理化性質表征。通過觀察輪胎微塑料在不同密度溶液中的漂浮、懸浮和沉底狀態來測量其密度范圍。使用掃描電鏡(S-4800，日立公司，日本)和激光粒度儀(MS2000，馬爾文公司，英國)測定輪胎微塑料顆粒的形貌和粒徑。使用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS；7700x，安捷倫公司，美國)測定輪胎微塑料中Na、Mg、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Ag、Cd和Pb等金屬的含量。

1.2.2 輪胎微塑料對大型溞的慢性毒性測試

大型溞慢性毒性實驗設置6個輪胎微塑料暴露組、1個陽性對照組(Cr濃度20 μg·L-1的K2Cr2O7溶液)和1個陰性對照組(脫氯自來水)，每組3個平行。其中輪胎微塑料暴露組包括了3個微塑料粒徑(100目、150目、200目)和0.5 mg·L-1、62.5 mg·L-1(預實驗顯示此濃度對大型溞的生產具有負效應)2個顆粒濃度。

毒性測試在光照培養箱中進行(與大型溞培養條件相同)。向每個盛有200 mL暴露液的250 mL錐形瓶中加入20只日齡<1 d的幼溞進行暴露。錐形瓶置于振蕩器(HY-2型，國華電器有限公司，中國)上，轉速30 r·min-1，使輪胎微塑料懸浮。暴露持續21 d，每日定時喂食斜生柵藻一次，喂食濃度為5×105cells·mL-1。每2 d更新一次暴露液。暴露期間每日觀察，記錄死亡數、蛻皮數、產幼數，同時將新生幼體取出，并用顯微鏡觀測死亡的大型溞以及大型溞蛻皮。21 d暴露結束后，收集存活的大型溞，用去離子水清洗后，置于2 mL離心管中，放入液氮冷凍，并冷凍干燥。凍干后大型溞稱取干質量，用于測定金屬元素濃度。

1.3 分析測試方法

1.3.1 輪胎微塑料顆粒密度的測定

參考Li等[7]的實驗方法，使用NaI溶液(1.8 g·cm-3)、酒精(0.8 g·cm-3)和去離子水(1.0 g·cm-3)，按不同體積比配制不同密度(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7和1.8 g·cm-3)的溶液。將少量輪胎微塑料顆粒分別加入不同密度溶液中，超聲混合5 min(KQ-5200DE超聲波清洗儀，昆山舒美超聲儀器有限公司，中國)后靜置24 h，觀察各溶液中微塑料的漂浮、懸浮和沉底狀態。

1.3.2 輪胎微塑料和大型溞體內金屬含量的測定

稱取一定質量輪胎微塑料或凍干的大型溞于2 mL離心管中，加入適量65% HNO3，冷消解過夜，然后在80 ℃下消解6 h。用超純水稀釋消解液，過濾(0.45 μm孔徑濾膜)。使用ICP-MS測定Na、Mg、K、Ca、Mn、Fe、Co、Ni、Cu和Zn等金屬含量。

1.3.3 大型溞體內蛋白質/脂肪的測定

取適量凍干大型溞與150 mg KBr固體混勻研磨成粉末，制成壓片后利用傅里葉紅外光譜儀(iS10，美國熱電公司)測定，得到各波長下能量含量變化，通過計算1 720～1 485 cm-1和3 000～2 830 cm-1這2個波段的面積比得到蛋白質與脂肪含量比[8]。

1.4 統計分析

在R(v4.1.2)中進行了方差分析(ANOVA)和事后檢驗(Tukey法)，以比較不同處理組與陰性對照組的內稟增長率等。數據需檢驗是否滿足殘差的正態分布(Shapiro-Wilk正態性檢驗)和方差齊性(Levene檢驗)，并在必要時進行對數轉化。當P<0.05時，認為差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 輪胎微塑料物理化學性質

2.1.1 顆粒密度

在密度為1.0 g·cm-3的溶液中，輪胎微塑料顆粒全部沉底；在1.1 g·cm-3的溶液中，顆粒部分懸??；在1.2 g·cm-3的溶液中，顆粒全部漂浮。這表明顆粒的密度范圍為1.0～1.2 g·cm-3(圖1)?？梢灶A測，進入水體的輪胎微塑料最終會沉入沉積物，但會有部分顆粒暫時懸浮于水中。本研究的受試生物大型溞是濾食性浮游動物，也會擾動并攝食表層沉積物，因而能通過不同方式攝食入輪胎微塑料。

2.1.2 顆粒粒徑

通過激光粒度儀進一步測定輪胎微塑料粒徑。過100目、150目和200目篩所得輪胎微塑料的平均粒徑的范圍為67～150 μm，這與環境中輪胎微塑料粒徑的文獻報道值相近。Kreider等[9]從路面收集輪胎微塑料顆粒，其粒徑為4～350 μm，中位值在100 μm。Leads和Weinstein[10]從水體和沉積物樣中分離獲得輪胎微塑料顆粒，近70%的顆粒尺寸在63～149 μm之間。SEM形貌觀察發現輪胎微塑料顆粒呈不規則的長條形和圓球形，表面粗糙(圖1)，這與在路面上收集到的輪胎磨損產生的顆粒具有相似性[10-11]。因此，本研究所使用的輪胎微塑料從粒徑和形貌上具有代表性。

圖1 輪胎微塑料顆粒密度測定結果及掃描電鏡觀測圖Fig. 1 Density measurement and scanning electron microscope observations of tire-derived microplastics

2.1.3 輪胎微塑料顆粒的金屬含量

輪胎微塑料含有大量的Ca (>15 mg·g-1)、Zn (>10 mg·g-1)、Na (4～6 mg·g-1)、K (2～3.5 mg·g-1)、Fe (2～5 mg·g-1)和Mg (0.9～2.5 mg·g-1)，中等含量的Cr (50～120 μg·g-1)、Mn (20～50 μg·g-1)、Co (5～20 μg·g-1)、Ni (30～70 μg·g-1)、Cu (30～130 μg·g-1)、Se (20～22 μg·g-1)、Pb (19～23 μg·g-1)，以及少量的As (0.4～0.6 μg·g-1)、Ag (0.02～0.03 μg·g-1)、Cd (0.5 μg·g-1) (表1)。不同粒徑的顆粒中Ca、Zn、Se、Cd和Pb的濃度范圍基本一致，而粒徑越小的顆粒含Na、Mg、K、Co和Cu濃度越高。這可能與輪胎微塑料上不同金屬的浸提效率有關。前幾種金屬的提取不受顆粒比表面積影響，而后幾種金屬的提取效率則受顆粒比表面積控制，表現為比表面積越大越易提取。

表1 不同粒徑的輪胎微塑料中金屬元素濃度Table 1 Metal concentrations in tire-derived microplastics of different particle sizes

2.2 輪胎微塑料對大型溞的慢性毒性效應

2.2.1 對存活率、蛻皮數和繁殖能力的影響

經21 d暴露，陰性對照組大型溞的死亡率在2%以內；陽性對照組的死亡率超過30%；輪胎微塑料暴露組的死亡率在5%～20%之間(圖2(a))。這說明不同粒徑和濃度的輪胎微塑料均會降低大型溞的存活率。輪胎微塑料暴露組的死亡率均不高于20%，說明毒性效應不大。此外，在濃度為0.5 mg·L-1的暴露組中，大型溞的存活率隨微塑料粒徑的減小而升高；而在62.5 mg·L-1的暴露組中，大型溞的存活率隨粒徑的減小而降低。

輪胎微塑料暴露沒有明顯改變大型溞的蛻皮頻率。如圖2(b)所示，暴露組與對照組的大型溞在21 d中蛻皮9次左右，平均蛻皮數接近。

輪胎微塑料暴露對大型溞的繁殖有可觀測的影響(圖2(c))。暴露組的累積產幼數量接近甚至高于陰性對照組，但是暴露組的初次生產時間滯后于陰性對照組。暴露于62.5 mg·L-1的輪胎微塑料，大型溞初次生產的時間延后3～5 d。而暴露濃度為0.5 mg·L-1時，生殖延后效應較小，僅在較大粒徑(100目)組觀察到初次生產時間延后4 d。該結果表明輪胎微塑料對大型溞繁殖能力的不利影響主要體現在發育抑制上，而非體現在產幼數量上。

圖2 暴露于不同粒徑、濃度輪胎微塑料的大型溞21 d存活率(a)、存活個體累積平均蛻皮數(b)和存活雌性個體累積平均產幼數(c)Fig. 2 Survivorship (a), accumulative number of moltings (b) and offspring (c) of Daphnia magna in the 21-d exposure to tire-derived microplastics of different particle sizes and concentrations

內稟增長率(rm)綜合反映輪胎微塑料對大型溞生存與繁殖的影響(圖3(a))。暴露于62.5 mg·L-1的輪胎微塑料，rm值(0.231～0.255 d-1)顯著低于陰性對照的(0.294±0.014) d-1(F3,8=18.15,P<0.01)，而與陽性對照的(0.250±0.011) d-1接近 (F3,8=2.987,P=0.096)。暴露于0.5 mg·L-1的輪胎微塑料，rm值與陰性對照組接近，種群增長速率未受影響。

圖3 暴露于不同粒徑、濃度輪胎微塑料的大型溞內稟增長率(rm) (a)和體內蛋白質/脂肪的含量比(b)注：灰色水平實線和虛線是陰性對照組的內稟增長率或蛋白質/脂肪的含量比值(均值±標準差)，紅色水平實線和虛線是陽性對照組的內稟增長率或蛋白質/脂肪的含量比值(均值±標準差)；*表示處理組與陰性對照有顯著差異(ANOVA，Tukey檢驗，P<0.05)。Fig. 3 Intrinsic population growth rate (rm) (a) and protein-to-lipid ratio (b) of Daphnia magna exposed to tire-derived microplastics of different particle sizes and concentrationsNote: Grey solid and dashed lines represent negative control for intrinsic population growth rate or protein-to-lipid ratio (mean±standard deviation), and red solid and dashed lines represent its positive control (mean±standard deviation); *represents P<0.05, compared with negative control (ANOVA，Tukey test).

2.2.2 對大型溞體內金屬元素濃度的影響

在低濃度(0.5 mg·L-1)暴露水平下，輪胎微塑料的存在基本不會引起大型溞體內金屬含量的變化，而高濃度的輪胎微塑料暴露會導致大型溞體內重金屬Co、Cu和Zn的增加以及生長的必需金屬元素Ca、Fe的減少(圖4)。62.5 mg·L-1輪胎微塑料實驗組中的大型溞體內重金屬Co、Cu、Zn含量高于陰性對照組和低濃度實驗組(圖4(a))；而大型溞體內生長的必需金屬元素Ca和Fe的含量則低于陰性對照組和低濃度實驗組(圖4(b))。輪胎微塑料暴露對其他元素(Ag、As、K、Mg、Mn、Na、Pb和Se等)的濃度沒有明顯的影響(數據未顯示)。

圖4 暴露于不同粒徑、濃度輪胎微塑料的大型溞體內Co、Cu、Zn含量(a)和Ca、Fe含量(b)注：藍色水平實線和虛線是陰性對照組的金屬濃度(均值±標準差)。Fig. 4 Concentrations of Co, Cu, Zn (a) and Ca, Fe (b) in Daphnia magna exposed to tire-derived microplastics of different particle sizes and concentrationsNote: Blue solid and dashed lines represent negative control (mean±standard deviation).

高濃度暴露處理明顯提升大型溞體內Zn的含量，說明在高濃度暴露水平下，被大型溞攝入的輪胎微塑料顆粒在其腸道內釋放重金屬Zn，進而產生毒性效應，使大型溞死亡率增加。同時，輪胎微塑料顆粒在腸道內的停留可能減少大型溞對食物的攝入，并且Zn干擾了Ca和Fe的吸收，這使得大型溞體內Ca和Fe元素含量下降，從而抑制了大型溞的生長發育，使大型溞初次生產的時間延遲3～5 d。因此，在高濃度暴露水平下，輪胎微塑料被大型溞攝入后，顆粒本身及其釋放的有害物質導致大型溞死亡率的增加和生殖延后。

在高濃度實驗組中，大型溞體內重金屬Co、Cu和Zn的含量隨輪胎微塑料粒徑的減小而呈現上升趨勢(圖4(a))。這與暴露實驗中大型溞的死亡率的規律一致，進一步說明高濃度輪胎微塑料對大型溞的毒性主要是由其釋放的Zn等重金屬引起的。低濃度暴露組中大型溞體內重金屬Zn的含量與陰性對照組差別不大，這表明低濃度輪胎微塑料對大型溞的毒性不是由其釋放的毒性物質主導的，而主要是由顆粒本身所導致的。

2.2.3 對大型溞體表的影響

通過顯微鏡觀察到大型溞蛻皮內外表面粘附著大量輪胎微塑料顆粒。死亡個體的腸道內也充塞著輪胎微塑料，且有大量顆粒粘附在其附肢表面(圖5)。這說明輪胎微塑料會阻塞大型溞的消化道，并會干擾其運動和濾食。

圖5 暴露于輪胎微塑料的死亡大型溞個體及大型溞蛻皮的顯微鏡觀察圖Fig. 5 Microscopic observation of the dead individuals of Daphnia magna and the shed molts after exposure to tire-derived microplastics

2.2.4 對蛋白質/脂肪的影響

實驗組與陰性對照組的大型溞體內蛋白質/脂肪的值大小相似，但低于陽性對照組(圖3(b))。陽性對照組中Cr(Ⅵ)毒性使得大型溞體內脂肪消耗增加，從而導致蛋白質/脂肪的增大。輪胎微塑料攝入雖然會阻塞消化道并對大型溞產生刺激作用，但并未改變大型溞體內蛋白質和脂肪的消耗和分配。

3 討論(Discussion)

在環境相關濃度下，輪胎微塑料會對大型溞產生一定的慢性毒性。本研究發現暴露在0.5 mg·L-1輪胎微塑料中21 d，大型溞的死亡率(5%～20%)高于陰性對照組(2%)，且較大粒徑的輪胎微塑料使大型溞初次生產的時間延后了4 d。而關于輪胎微塑料對大型溞的急性毒性研究發現625～10 000 mg·L-1的輪胎磨損顆粒在標準實驗溫度(21 ℃)條件下的浸出液均不會導致大型溞的死亡[6]。本研究中輪胎微塑料之所以會對大型溞產生慢性毒性，可能是由于暴露時間的延長導致的，也可能是輪胎微塑料在更長的暴露時間中釋放出的化學物質所導致的。

雖然暴露在環境相關濃度水平下的輪胎微塑料會對大型溞產生一定的慢性毒性，但毒性較小。在本研究中，0.5 mg·L-1輪胎微塑料懸浮液中大型溞的死亡率均<20%，輪胎微塑料對蛻皮頻率和平均產幼數量均無明顯的不利影響，這與一些研究結果相似。Redondo-Hasselerharm等[2]研究發現即使是在暴露濃度為沉積物干質量的10%的情況下，沉積物中的輪胎磨損顆粒對底棲動物鉤蝦、櫛水虱、顫蚓和帶絲蚓的影響很小。Khan等[12]在鉤蝦的毒性測試中也發現，在較高的暴露濃度(0.15～0.59 g·L-1)下，鉤蝦的存活率、繁殖率和生長率才會受到顯著的負面影響。但Wik等[5]的研究表明在環境預測濃度(13 mg·L-1)水平下，輪胎微塑料對網紋溞的9 d繁殖率有顯著影響，其毒性測試中僅使用了輪胎胎面顆粒的浸出液。已有研究確定輪胎微塑料與胎面顆粒的化學組成存在較大差異[9]，二者所釋放的化學物質也會不同。此外，Halle等[13]的研究比較了使用研磨機制作的輪胎微塑料的懸浮液和浸出液對端足類生物的急性毒性，結果表明在整個測試范圍內(0～2.55 g·L-1)輪胎微塑料懸浮液的毒性比輪胎微塑料浸出液更高，且研究發現浸提操作并未將某些有害物質(辛硫醇、菲、蒽和鋁)提出。這表明用浸出液來測試輪胎微塑料對水生生物的毒性并不能準確評估真實環境中輪胎微塑料的生態風險。

輪胎磨損顆粒浸出毒性研究表明，浸出液中的Zn和有機物是輪胎磨損顆粒對水生生物產生毒性效應的主要原因，且輪胎磨損顆粒對水生生物的毒性大小取決于它的量和其釋放的有害物質的量[5-6]。Tian等[14]的研究發現輪胎橡膠中的一種抗氧化劑是導致美國太平洋西北部銀鮭魚在小溪中繁殖時急性死亡的主要原因。但已有研究發現多種水生生物可以攝入輪胎磨損顆粒[2,12]，且Halle等[13]的研究發現暴露在高濃度的2種不同化學組成的輪胎磨損顆粒中，對端足類的毒性一致，這說明其對端足類生物的毒性是由顆粒的物理性質決定的，輪胎磨損顆粒是通過改變生物的攝食行為及營養攝入對端足類產生毒性影響。本研究中，低濃度的輪胎微塑料(0.5 mg L-1)不會引起大型溞體內重金屬Co、Cu和Zn等毒性物質含量的變化，這表明在低濃度暴露水平下，輪胎微塑料對大型溞的毒性不是由其釋放的毒性物質所主導的，而主要是通過顆粒對大型溞附肢的干擾以及對腸道的刺激等物理因素所引發的。在高濃度暴露水平下，大型溞體內重金屬Co、Cu和Zn等毒性物質的含量明顯增加，且在所研究的微塑料粒徑范圍內呈現出金屬累積量隨顆粒粒徑的減小而上升的趨勢，而大型溞的死亡率同樣隨顆粒粒徑的減小而增大。這說明在高濃度暴露水平下，輪胎微塑料對大型溞的毒性是由其釋放的毒性物質所主導的。因此，大型溞是通過攝入輪胎微塑料，顆粒本身及其釋放的有害物質對其產生毒性影響[15]，但在環境相關濃度水平下，毒性是由顆粒本身的作用主導的?？紤]到輪胎磨損顆粒的成分較為復雜，重金屬只是其中的部分組分[14]，將來研究有必要關注其他組分可能產生的毒性效應。

綜上所述，本文探究了輪胎微塑料對大型溞的慢性毒性效應和毒性機理。結果表明，在地表水中，輪胎微塑料的預測濃度為0.09～10 mg·L-1時，其對大型溞的慢性毒性影響很小，且其對大型溞的慢性毒性是由顆粒本身的物理性質所引起的。少量輪胎微塑料顆粒的攝入對大型溞腸道產生了刺激，但并未改變其體內重金屬和營養金屬的含量以及蛋白質/脂肪。然而，對于某些道路沖刷雨水的直接受納水體，其輪胎微塑料濃度可能高達幾十mg·L-1[3]，這就可能抑制水生生物(如大型溞)的生長發育，并降低水生生物的存活率，從而威脅水生生態系統的健康。