聚乙烯微塑料對尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)生長、抗氧化、免疫和腸道微生物的影響

張曉飛，余秋然，趙宇航，石展耀，周利，李二超，謝嘉,*

1. 海南大學海洋學院，?？?570228 2. 華東師范大學生命科學學院，上海 200241

近年來，塑料被廣泛應用于工業、農業生產、醫療衛生和商品包裝中，且需求量巨大。當前，塑料產量從1950年代的150萬t增加至2018年的3.6億t，2018年中國的塑料產量占世界塑料產量的30%[1]。然而，塑料廢棄物處置不當所引發的環境污染問題，引起了世界范圍內的廣泛憂慮[2]。塑料產品在風化和侵蝕后會破碎成較小的碎片，美國國家海洋和大氣管理局(NOAA)將長度<5 mm的塑料碎片定義為微塑料(microplastics, MPs)[3]。如今MPs已成為非常受關注的新污染物，因其難降解、在環境中可長距離運輸等特性，對生態系統產生的危害引起了全球關注。塑料薄膜殘留物的分解、地表徑流、污水灌溉和大氣沉降等原因，導致了微塑料MPs容易在土壤中累積，據調查，工業和農業區域土壤中的MPs可高達300～67 500 mg·kg-1[4]。但在風力、地下滲透和雨水沖刷的作用下，微塑料MPs通過地表徑流和河流匯入海洋，使其成為微塑料MPs的最終聚集地。據報道，長江口表層水中MPs的平均豐度為900 n·m-3[5-6]，珠江三角洲每年估計有390億個(約66 t)MPs顆粒從河流匯聚入海[7]，MPs最終匯聚入海，在全球近海、大洋、深海和極地海洋表面大約有5.25萬億個MPs顆粒漂浮，總質量可達2.7×105t[8]。

MPs易被水生生物攝入，科學家們在貽貝、魚類等水生物體內均發現了MPs的存在[3,9-12]。有報道稱，當MPs進入機體后會導致斑馬魚(zebrafish)和珊瑚魚(Acanthochromispolyacanthus)的行為異常、抑制魚體的生長[13-14]；使歐州鱸魚(Dicentrarchuslabrax)[15]、羅非魚(Oreochromisniloticus)的免疫防御功能降低、擾亂機體的脂質代謝[16]。此外，MPs還會在水生生物的腸道內累積，使機體腸道菌群紊亂[17]。有研究發現MPs可通過影響魚類腸道菌群組成，進而擾亂機體的營養吸收和能量代謝[18]；此外，MPs還會導致斑馬魚腸道菌群紊亂從而引起腸道炎癥，并誘導機體產生氧化應激[19]。

目前國內外學者已開展了大量有關微塑料對魚類的毒性效應研究，但微塑料的種類選擇多為聚苯乙烯(PS)[20-23]，對聚乙烯的毒性效應研究鮮見報道。尼羅羅非魚是雜食性魚，具有生長、繁殖快、抗逆性強等特性，是海南省重要的經濟養殖魚類，也是重要的科研用淡水養殖魚類[24-25]。因此，本文采用尼羅羅非魚作為實驗對象，研究高密度聚乙烯(HDPE)對其生長性能、生理生化功能以及腸道菌群結構的影響，研究結果可為微聚乙烯塑料對水生生物的毒性效應及其生態風險評估提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

尼羅羅非魚仔魚購自海南省?？谑泻Ｄ喜Ⅳ~鱉種苗場，馴養1周，實驗用淡水經200目篩絹過濾，提前曝氣24 h后備用。

高密度聚乙烯粉末，粒徑61～83 μm(95.5%)，密度約為1 000 n·mg-1，購自上海冠步科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 尼羅羅非魚暴露實驗

暴露實驗在玻璃缸(60 cm×30 cm×35 cm)中進行，實驗水體為30 L，每組設置3個重復，隨機選擇180尾(每缸15尾)大小相近健康幼魚((23.9±0.46) g)分別放入HDPE濃度為0、0.01、0.1和5 mg·L-1的淡水中，HPDE暴露濃度的設計依據海南海域實測環境濃度和前期預實驗。實驗期間連續曝氣，每日投喂羅非魚飼料(約占體質量的3%)2次，日換水量100%，暴露28 d后進行取樣，取樣前禁食24 h，收集魚腦、腸和肝臟，肝臟稱量濕質量，其他分別放入1.5 mL的無菌離心管中，然后將樣品置于液氮中速凍，樣品儲存在-80 ℃超低溫冰箱中待后續分析。

1.2.2 生長指標的測定

參考[25-26]的方法，進行生長性能指標的測定：

成活率(survival rate, %)=成活數量/總數量×100%
增重率(weight gain rate, %)=(Wt-W0)/W0×100%
肝體指數(hepatosomatic index, HI, %)=WI/Wt×100%
肥滿度(condition factor, %)=Wt/Lt3×100%

式中：W0、WI、Wt和Lt分別為尼羅羅非魚的初始體質量(g·尾-1)，尼羅羅非魚肝臟質量(g·尾-1)，實驗終末尼羅羅非魚體質量(g·尾-1)和終末魚體長(cm)。

1.2.3 CAT、T-AOC、AKP、ACP、AChE酶活性和MDA含量的測定

每組肝臟和魚腦稱重約0.1 g，用0.86%預冷的生理鹽水溶液制成10%(V/m)的勻漿。將勻漿液在4 ℃下2 500 r·min-1離心10 min。立即提取上清液，接著用酶標儀(Bio-RAD，美國)分析其生化參數。丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和乙酰膽堿酯酶(AChE)等試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2.4 16S rDNA高通量測序檢測MPs對腸道微生物的影響

使用杭州福來納米技術有限公司提供的商業磁珠DNA分離試劑盒，從每個腸道中提取基因組DNA(gDNA)。所有提取的gDNA均通過紫外光譜和電泳進行定量，以供進一步分析。此外，采用以下方案通過實時qPCR擴增每個樣品中的部分gDNA：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s和72 ℃持續1 min，重復40個循環，然后72 ℃持續10 min。用靶向細菌16S rDNA基因V3和V4區的特異性引物(正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；反向引物：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)擴增gDNA樣品。此外，在Illumina MiSeq平臺上使用雙索引擴增和測序，然后進行QIIME(vision 1.9.0)生物信息學分析，檢測腸道菌群的組成。為了評估腸道菌群的α多樣性，使用QIIME計算豐富度指數(ACE、Chao1指數)和多樣性指數(Shannon、Simpson指數)。同時，通過KEGG系統分析羅非魚腸道微生物基因功能。

1.3 數據統計與分析

所有數據用平均值±標準誤(Mean±SE)的方法表示，酶活數據使用SPSS(社會科學統計軟件包)25.0軟件(美國SPSS Inc.)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan檢驗對數據進行差異性分析，顯著水平為P<0.05。腸道微生物數據采用Student’s T檢驗進行差異性分析，顯著水平為P<0.05。

2 結果(Results)

2.1 生長和存活指標

與對照組相比，HDPE暴露28 d后，尼羅羅非魚的增重率、成活率和肝體比均無明顯變化(P>0.05)(圖1(a)、(b)和(d))。而0.1 mg·L-1和5 mg·L-1HDPE暴露組中尼羅羅非魚的肥滿度顯著低于對照組(P<0.05)(圖1(c))。

圖1 高密度聚乙烯微塑料(HDPE)暴露28 d對尼羅羅非魚的增重率(a)、成活率(b)、肥滿度(c)和肝體比(d)的影響注：不同小寫字母表示不同處理組間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 1 Effect of high-density polyethylene (HDPE) on weight gain rate (a), survival rate (b), condition factor (c) and hepatosomatic index (d) of O. niloticus after exposure for 28 dNote: Different lowercase letters represent significant difference between each group (P<0.05).

2.2 MDA含量與抗氧化酶活性

經HDPE暴露28 d后，0.01 mg·L-1和5 mg·L-1HDPE暴露組尼羅羅非魚肝臟MDA含量顯著高于對照組(P<0.05) (圖2(a))；T-AOC、SOD和CAT活性與對照組相比無顯著差異(P>0.05)(圖2(b)、(d)和(e))。尼羅羅非魚肝臟GST活性僅在5 mg·L-1暴露組中顯著升高(P<0.05)(圖2(c))。

圖2 HDPE暴露28 d對尼羅羅非魚肝臟組織丙二醛(MDA) (a)、總抗氧化能力(T-AOC) (b)、谷胱甘肽轉移酶(GST) (c)、超氧化物歧化酶(SOD) (d)和過氧化氫酶(CAT) (e)的影響注：不同小寫字母表示不同處理組間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 2 Effect of HDPE on malondialdehyde (MDA) (a), total-antioxidant capacity (T-AOC) (b), gultathione S-transferases (GST) (c), superoxide dismutase (SOD) (d) and catalase (CAT) (e) in liver of O. niloticus after exposure for 28 dNote: Different lowercase letters represent significant difference between each group (P<0.05).

2.3 神經毒性和免疫功能

經HDPE暴露28 d后，尼羅羅非魚腦組織中AChE活性以及肝臟組織中AKP活性與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)(圖3(a)和(c))，0.1 mg·L-1暴露組尼羅羅非魚肝臟組織中ACP活性顯著高于對照組(P<0.05)(圖3(b))。

圖3 HDPE暴露28 d對尼羅羅非魚腦組織乙酰膽堿酯酶(AChE) (a)、肝臟組織酸性磷酸酶(ACP) (b)和堿性磷酸酶(AKP) (c)的影響注：不同小寫字母表示不同處理組間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 3 Effect of HDPE on acetylcholinesterase (AChE) in brain (a), acid phosphatase (ACP) in liver (b) and alkaline phosphatase (AKP) in liver (c) of O. niloticus after exposure for 28 dNote: Different lowercase letters represent significant difference between each group (P<0.05).

2.4 腸道菌群豐度與結構功能

OTU(Operational Taxonomic Units)是人為把相似度>97%的分類單元(品系、屬、種、分組等)序列進行聚類而設置的統一標志。Veen圖用來統計樣本之間OTU組成的相似情況，通常情況下，分析時選用相似水平為97%的OTU。如圖4顯示，0.01、0.1和5 mg·L-1HDPE暴露組與對照組之間共有的OTU數目分別為34、30和8。

圖4 HDPE暴露28 d尼羅羅非魚腸道微生物Venn圖Fig. 4 Veen diagram of intestinal microbiota after O. niloticus exposed to HDPE for 28 d

Alpha多樣性分析顯示，Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 HDPE暴露28 d尼羅羅非魚腸道菌群的Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity of intestinal microbiota after O. niloticus exposed to HDPE for 28 d

在門水平上，放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、藍細菌門(Cyanobacteria)和衣原體門(Chlamydiae)是尼羅羅非魚腸道內的優勢物種，其他物種豐度占比均<1%。其中，5 mg·L-1HDPE暴露組的尼羅羅非魚腸道中，衣原體門顯著高于對照組(P<0.05)(圖5(a)和(b))。

圖5 HDPE暴露28 d后尼羅羅非魚腸道微生物門水平物種組成(a)及組間差異(b)注：*表示P<0.05。Fig. 5 Composition of intestine microbiota at the phylum level of O. niloticus (a) and differences between groups (b) after exposure to HDPE for 28 dNote: *represents P<0.05.

在屬水平上，戈登氏菌屬(Gordonia)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、紅球菌屬(Rhodococcus)和鄰單胞菌屬(Plesiomonas)為尼羅羅非魚腸道內的優勢屬。由Student’s T檢驗，0.01 mg·L-1HDPE暴露組未定義到屬的芽孢桿菌目(norank_f_norank_o_Bacillales)顯著高于對照組(P<0.05)；0.1 mg·L-1HDPE暴露組腸桿菌屬(Enterobacter)顯著高于對照組(P<0.05)；5 mg·L-1暴露組未定義到屬的副衣原體科(norank_f Parachlamydiaceae)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、假紅游動菌屬(Pseudorhodoplanes)、norank_f_JG30-KF-CM45、諾卡菌屬(Nocardioides)、井桿菌屬(Phreatobacter)、微單胞菌屬(Micromonospora)、未定義到屬的衣藻科(norank_f_Holosporaceae)和鏈霉菌屬(Streptomyces)均顯著高于對照組(P<0.05)(圖6(a)和(b))。

圖6 HDPE暴露28 d后尼羅羅非魚腸道微生物屬水平物種組成(a)及組間差異(b)注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 6 Composition of intestine microbiota at the Genus level of O. niloticus (a) and differences between groups (b) after exposure to HDPE for 28 dNote: *represents P<0.05, **represents P<0.01.

根據KEGG基因功能預測分析可知，0.1 mg·L-1HDPE暴露組尼羅羅非魚的腸道菌群中雙組分系統(two-component system)、嘧啶代謝(pyrimidine metabolism)、氨?；?1RNA生物合成(aminoacyl-1RNA biosynthesis)和同源重組(homologous recombination)通路與對照組相比顯著上調(P<0.05)，5 mg·L-1HDPE暴露組中脂肪酸降解(fatty acid degradation)和色氨酸代謝(tryptophan metabolism)通路與對照組相比顯著上調(P<0.05)(圖7)。

圖7 HDPE暴露28 d后尼羅羅非魚腸道菌群KEGG功能預測分析注：*表示P<0.05。Fig. 7 KEGG prediction analysis of intestinal microbiota after O. niloticus exposed to HDPE for 28 dNote: *represents P<0.05.

3 討論(Discussion)

本研究中，高密度聚乙烯微塑料未導致尼羅羅非魚死亡，且與對照組相比，尼羅羅非魚的增重、成活率和肝體比均無顯著變化，這和前人的研究結果相似[22,27-29]。也有報道稱，MPs可以降低金鯛魚的生長[14]，這可能與MPs的粒徑大小有關，有研究表明，MPs粒徑越小對機體的危害越大[15,30]。

當機體受到環境脅迫時，體內活性氧平衡被打破，產生過多的過氧化產物[31]。MDA作為脂質過氧化的終產物，其含量水平可作為機體過氧化程度的指標[32]。SOD、CAT、GST和T-AOC等構成機體抗氧化酶系統。在本研究中，HDPE暴露28 d后，尼羅羅非魚肝臟中MDA含量和GST酶活性顯著升高，但SOD、CAT和T-AOC酶活性無顯著變化。這與金魚暴露于聚氯乙烯微塑料4 d后，肝臟中的MDA含量和GST活性顯著升高的結果一致[33]。當鯛魚暴露于低密度聚乙烯微塑料21 d后，肝臟中GST酶活性也顯著升高[34]。以上結果表明，在聚乙烯的MPs脅迫下，會引起尼羅羅非魚的氧化應激，激活機體的抗氧化防御系統。

AChE是一種與神經沖動傳遞有關的必需酶，當機體暴露于環境污染物時，其活性易被抑制[35]。本研究結果顯示，75 μm HDPE暴露28 d后，對羅非魚沒有神經毒性效應。這與以往的研究不同，據報道，當0.1 μm聚苯乙烯暴露14 d后，紅羅非魚AChE活性被抑制[22]；在飼料中添加10～600 μm的聚乙烯后，斑馬魚會因為神經損傷產生癲癇的癥狀[13]；暴露于100～400 μm聚乙烯和聚丙烯混合物，對楔形蛤(Donaxtrunculus)產生神經毒性[35]。推測這可能和MPs粒徑大小和模式生物有關。研究表明，粒徑小的MPs可以通過血液循環轉移到機體的不同組織[27,29]，當MPs通過血腦屏障進入腦組織中時就會對機體產生神經抑制，而粒徑大的MPs無法通過血液屏障，因此主要存在于胃腸道中[36-37]。此外，相較于底棲動物，尼羅羅非魚的生物累積效應低，且具有較強的解毒能力，所以推測HDPE對尼羅羅非魚的神經毒性影響較小。

魚類在抵抗外界脅迫的過程中，主要依靠其非特異性免疫防御系統進行防御[38]。非特異性防御機制是通過免疫相關酶來抵抗異物的侵入，從而提高自身免疫力，其中磷酸酶是非常重要的非特異性免疫酶[39]，也是動物體內的解毒體系[40]，可通過直接溶解或消化外源物質達到防御目的[41]。根據磷酸酶催化作用最適pH的特性，可分為酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)[42]。在本研究中，尼羅羅非魚在HDPE暴露28 d后對AKP活性并未造成顯著影響，而0.1 mg·L-1HDPE暴露組的ACP活性顯著升高。有研究表明當黑海參(Holothuriaatra)暴露于MPs后，AKP活性沒有顯著變化[43]，而ACP活性升高，表明MPs會影響機體內的免疫防御反應。

腸道微生物可以調節宿主的生長代謝、免疫防御，屏蔽病原微生物入侵，對宿主健康起著非常重要的作用[18]。研究表明，MPs可以在腸道內累積，對腸道微生物群結構和宿主健康存在威脅[29]。本研究發現，HDPE暴露28 d后，尼羅羅非魚腸道微生物的Alpha多樣性與對照組相比無顯著差異，此外，羅非魚腸道菌群Veen圖顯示隨HDPE暴露濃度的升高腸道菌群OTU數逐漸減少。以上結果表明，HDPE脅迫后可能會引起尼羅羅非魚腸道菌群紊亂，且高濃度HDPE暴露組效應最明顯。

據報道，變形菌門、梭桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和藍細菌門是羅非魚腸道中的優勢菌群[44-45]，其中變形菌門和擬桿菌門豐度下降會降低機體的免疫防御功能[46]。在本研究中，尼羅羅非魚腸道中變形菌門、擬桿菌門的豐度隨著HDPE暴露濃度增加而減少，表明HDPE對尼羅羅非魚腸道菌群的免疫功能造成潛在影響，且與暴露濃度有關。藍細菌門能產生自由基分解MPs[47]，在本研究中，其豐度減少表明高濃度HDPE暴露可以降低尼羅羅非魚腸道降解MPs的能力。此外，5 mg·L-1HDPE暴露組尼羅羅非魚腸道菌群中衣原體門豐度顯著高于對照組(P<0.05)。衣原體作為一種致病菌，可以感染的宿主非常多[48]，許多衣原體對動物和人類都有致病性，可作為疾病傳播的媒介，構成人畜共患病[49]。對于水產動物而言，衣原體可以引起魚類產生上皮樣囊腫，上皮樣囊腫是一種新型的水產養殖疾病，其特征是在魚類的鰓或皮膚上形成細胞質包涵體，引發魚類的鰓粘膜粘連壞死或組織增生進而導致魚體死亡，且衣原體在魚類中感染率可達4%～100%[50]，嚴重危害養殖動物健康[51-52]。當尼羅羅非魚暴露于高濃度MPs后，衣原體門豐度顯著升高，表明聚乙烯MPs對尼羅羅非魚的腸道健康造成危害。未定義到屬的芽孢桿菌目和腸桿菌屬屬于腸道益生菌，具有免疫增強作用[53-54]，小單胞菌屬、鏈霉菌屬和放線菌屬可以產生抗菌和抗腫瘤特性物質[55]。當腸道菌群受到MPs脅迫時，其豐度增加，可能與機體的免疫防御反應有關。其中，在高濃度HDPE暴露組中，未定義到屬的副衣原體科含量增加最為明顯，表明高濃度MPs可以危害尼羅羅非魚腸道健康，進而對尼羅羅非魚的機體健康產生潛在風險。

KEGG通路功能預測分析結果顯示，機體受到MPs脅迫后0.1 mg·L-1HDPE暴露組雙組分系統、嘧啶代謝、氨?；?tRNA生物合成和同源重組通路與對照組相比，顯著上調(P<0.05)。其中，雙組分系統通路屬于信號轉導功能，可以使細菌接收和響應細胞內外的各種物理、化學和生物刺激[56]，其通路上調說明MPs刺激腸道內的信號轉導增強；嘧啶代謝和癌細胞增殖有關，在癌細胞中嘧啶代謝酶會過度表達；氨?；?tRNA生物合成和同源重組屬于翻譯功能，氨?；鵷RNA合成酶(AARS)是翻譯機制的重要組成部分，可以催化氨基酸特異性附著在同源tRNA上[57]，為蛋白質生物合成提供原料，也可為細胞增殖提供所需的酶[58]。因此，推測聚乙烯微塑料會誘導尼羅羅非魚腸道內腫瘤細胞或癌細胞增殖。以上4條通路均滿足了癌細胞快速增殖的條件，但具體作用機制還需要進一步探究。

在5 mg·L-1HDPE暴露組中，尼羅羅非魚腸道中脂肪酸降解和色氨酸代謝通路顯著高于對照組。魚類主要依賴脂代謝為機體提供能量[59]，當魚類暴露于MPs后機體脂代謝增加，表明機體通過調動儲備能量來維持生存，進而導致機體儲備能量降低。此外，腸道中色氨酸代謝產物可參與腸道通透性、炎癥調節和宿主免疫反應[60]，還可介導宿主的T細胞和B細胞免疫[61]。色氨酸代謝通路上調表明尼羅羅非魚暴露于聚乙烯微塑料后，其腸道免疫防御系統被激活，這可能是MPs引起機體儲備能量降低，進而導致機體免疫能力下降所致。

綜上所述，HDPE暴露尼羅羅非魚后對其生長、免疫和神經系統沒有顯著影響，但可以造成氧化損傷，使其腸道菌群發生紊亂，其中，腸道菌群中衣原體門豐度的增加會危害腸道和機體健康。在本研究中已經檢測到KEGG功能通路的變化，但其具體影響機制還有待進一步研究。