殺菌劑對蜜蜂生理和行為的毒性效應研究

熊曼瓊，覃淦，王梨竹，黃少康，李江紅，段辛樂,*

1. 福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)，福州 350002 2. 農業農村部福建蜜蜂生物學科學觀測站，福州 350002

蜜蜂是自然界最重要的授粉昆蟲，全球80%的經濟作物依賴蜜蜂授粉，其對促進植物遺傳多樣性和維持生態平衡具有重要的作用[1]。在我國，每年有約500多萬群流動蜂群在生產蜂產品的同時可為大宗農作物授粉[2]；據測算，蜜蜂授粉對我國36種主要作物的年均價值貢獻高達3 042.20億元，占我國農業總產值的12.30%[3]。

隨著農業集約化、規?；彤a業化的發展，生態環境受到破壞，生物多樣性下降，野生授粉昆蟲數量銳減，使得家養蜜蜂對生態環境的作用更加突出，其在生物多樣性和生態平衡等生態貢獻遠大于其授粉所產生的經濟價值[4-5]。如果授粉昆蟲持續減少，必定會引發農作物授粉危機，進而影響全球的作物產量及生態環境[6]，威脅糧食安全和生態安全。影響蜜蜂生存的因素有多種，如氣候變化、遺傳特性、農藥使用、寄生蟲和病毒疾病暴發等[7]，其中農藥中毒導致蜜蜂死亡、蜂群數量驟減的現象已成為全球普遍關注的環境污染與生物安全問題[8-10]。

殺菌劑是作物病害防治的重要農業物資，我國注冊登記可用于蜜粉源植物病害防治的殺菌劑有128種，多為唑類、無機類及金屬類、苯胺及酰胺類(表1)[10]。因蜜源植物病害防治的需要，生產上經常會在其開花期進行噴藥，蜜蜂在采集過程中可直接接觸到殺菌劑[11]；同時殺菌劑被植物吸收后會出現在花蜜、花粉和露水中，被蜜蜂采集后帶回蜂巢，導致蜂群內蜂蜜、花粉和巢脾被污染，進而影響其幼蟲和成蜂的生長發育和生理狀態[12]。殺菌劑的作用機制主要是通過影響核酸和蛋白質的合成、呼吸作用、信號傳導、細胞分裂和細胞膜的結構和功能，以達到抑菌或殺菌效果[13]；因此殺菌劑的田間推薦使用劑量不會導致蜜蜂急性死亡，但其田間殘留仍會對蜜蜂行為、生長發育、繁殖、學習記憶和免疫產生影響[12-17]。

本文綜述了殺菌劑對蜜蜂生長發育、生理和行為等健康方面影響的研究進展，探究殺菌劑對蜜蜂的脅迫效應，以期尋求減少或降低蜜蜂中毒的方法，更好地保護蜜蜂，使其更好地應用于授粉生產實踐，也為進一步協調蜜蜂授粉與綠色防控技術體系的應用，為農作物授粉安全和我國農藥使用安全性評價提供理論指導。

1 殺菌劑對蜜蜂的毒性作用(Toxic effects of fungicides to bees)

目前，評價殺菌劑對蜜蜂的毒性主要是依據國家標準《化學農藥環境安全評價試驗準則》第10部分，即“蜜蜂急性毒性試驗[18]”。該標準提出通過測定藥劑的急性經口毒性和急性接觸毒性，確定藥劑對蜜蜂的致死中劑量(LD50)，根據致死中劑量將農藥對蜜蜂毒性劃分為4個等級：LD50>11.0 μg·蜂-1時，該殺菌劑對蜜蜂的毒性為低毒；2.0 μg·蜂-1

趙帥等[19]分析了59種殺菌劑對意大利蜜蜂(Apismellifera)的急性經口毒性，發現51種殺菌劑對意大利蜜蜂的毒性均表現低毒，8種殺菌劑為中毒及中毒以上毒性。蒼濤等[20]研究發現，多菌靈、噻嗪酮、腐霉利、異菌脲和百菌清對意大利蜜蜂的急性經口毒性屬于低毒，乙蒜素、咪鮮胺對意大利蜜蜂為中毒。賈變桃等[21]研究發現，丙森鋅、苯醚甲環唑、石硫合劑、甲基硫菌靈、烯酰嗎啉、氟菌唑和三環唑對意大利蜜蜂的急性經口和接觸毒性均為低毒；而氟硅唑對意大利蜜蜂的接觸毒性為高毒，丙環唑和咪鮮胺的接觸毒性為中毒，丙環唑和抑霉唑對意大利蜜蜂的經口毒性為中毒。王雅珺等[22]評估結果顯示，代森錳鋅、啶酰菌胺、腐霉利、烯酰嗎啉、氰霜唑、葉枯唑和春雷毒素等對中華蜜蜂(Apiscerana)的急性毒性均為低毒；腈菌唑和丙環唑對其的急性經口和急性接觸毒性均為中毒，咪鮮胺對中華蜜蜂的急性經口毒性為高毒，急性接觸毒性為中毒。Simon-Delso等[23]發現，啶酰菌胺在24 h和48 h對意大利蜜蜂無明顯的急性毒性，但在10～17 d出現累積毒性。譚麗超等[24]測定發現，250 g·L-1嘧菌酯懸浮劑、50%醚菌酯可濕性粉劑、15%吡唑醚菌酯懸浮劑和22.5%啶氧菌酯懸浮劑對意大利蜜蜂的經口毒性和接觸毒性均>100 μg (a.i.)·蜂-1，為低毒。因有效成分含量、助劑種類、劑型及加工工藝等的不同，導致相同有效成分的不同制劑對蜜蜂的毒性也各不相同[19,25]。趙帥等[19]測定發現，在6個不同的戊唑醇制劑中，25%戊唑醇乳油(emulsifiable concentrate, EC)和25%戊唑醇可濕性粉劑(wettable powder, WP)對意大利蜜蜂的毒性為劇毒，相同含量相同劑型的2個25%戊唑醇EC產品對意大利蜜蜂的毒性也存在差異。葉萱[25]發現助劑中的促滲透劑N-甲基-2-吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP)對意大利蜜蜂成蜂為中毒，對幼蟲為高毒。

2 殺菌劑對蜜蜂的影響(Influence of fungicides to bees)

2.1 殺菌劑對蜜蜂的生長發育的影響

作為典型的社會性昆蟲，蜜蜂個體的生長發育與蜂群的群勢相互影響。蜜蜂個體的生長發育決定了蜂群群勢的強弱；蜂群群勢越強，越有利于個體的生長發育[26]。蜜蜂可通過多種途徑直接或間接地接觸到殺菌劑，并將含有殺菌劑殘留的花粉和花蜜帶入蜂群中，進而對幼蟲和成蜂的壽命、發育歷期、化蛹率和羽化率等產生負面影響[16-17,27-29]。與對照相比，Eduardo da Costa Domingues等[30]發現吡唑醚菌酯高濃度處理(25 mg·L-1和125 mg·L-1)可導致意大利蜜蜂成蜂壽命顯著縮短；而低濃度處理5 mg·L-1對其幼蟲和蛹存活率、化蛹率和羽化率均無顯著影響[31]。丙環唑對意大利蜜蜂幼蟲的羽化率無顯著影響，隨著時間的延長，各處理組花粉消耗量顯著下降，蜂王的產卵量下降；且隨著處理濃度的升高，蜂子的存活率和壽命顯著下降[32-33]。Dai等[34]研究發現百菌清處理(30 mg·L-1和100 mg·L-1)對意大利蜜蜂幼蟲具有慢性毒性和累積效應，導致幼蟲和蛹死亡率增加，幼蟲發育速率減緩，其中對6日齡幼蟲影響最大，死亡率高于50%[35]；同時處理組采集蜂的數量顯著增多，且內勤蜂與采集蜂體質量、頭寬和翅膀長度均顯著低于對照[36]。Tomé等[37]發現，蜂蠟和花粉中的殘留的百菌清能顯著降低意大利蜜蜂工蜂的存活率，發育歷期延長，體質量下降，同時還可導致蜂王的產卵量下降[38]。王康等[15]的研究表明，亞致死劑量的多菌靈脅迫對意大利蜜蜂的蛹質量、化蛹率和羽化率無顯著影響，但可導致幼蟲的保幼激素滴度上升，蛻皮激素滴度顯著下降，進而影響幼蟲生長發育，造成幼蟲化蛹的發育遲緩。多菌靈(5 mg·mL-1和10 mg·mL-1)可增加蜜蜂對糖水的攝入量，減少花粉的消耗，顯著降低意大利蜜蜂的存活率[39]。

殺菌劑的復配劑或混合使用對蜜蜂的影響更為嚴重。Fisher等[29]研究發現，Pristine?(吡唑醚菌酯與啶酰菌胺的復配劑)可引起意大利蜜蜂蛋白質缺乏，營養不良，導致蜂群中工蜂壽命縮短，工蜂數量下降15%，影響蜂群越冬[40]。Johnson和Percel[41]研究認為，Pristine?對意大利蜜蜂蜂王的存活率和生長發育無顯著影響，但其可以降低蜂王體內的營養水平和免疫力，導致病毒滴度增加[42]。Milone等[43]通過室內測定發現，嘧菌酯對意大利蜜蜂蜂王幼蟲的存活率和體質量無顯著影響，其與腈苯唑、丙硫菌唑的混合處理可導致工蜂采集能力顯著下降43%。Tamburini等[44]通過田間實驗發現，按照使用說明中的使用濃度和方法，嘧菌酯不會對意大利蜜蜂個體和蜂群的發展(成蜂數、蜂子數和蜂群質量等)及采集蜂的數量、采集飛行次數等行為無影響，結果表明安全濃度范圍內的殺菌劑對意大利蜜蜂短期發育影響不大，但長期接觸該藥后導致的累積效應以及不同農藥間是否對意大利蜜蜂個體和群體的存在協同或拮抗作用還需要進一步研究。

2.2 殺菌劑對蜜蜂生理的影響

2.2.1 殺菌劑對蜜蜂解毒酶和保護酶活性的影響

作為外源有毒物質，殺菌劑進入蜜蜂體內后必定會引起其保護酶和解毒酶的應激反應[16]。菌核凈、咪鮮胺和異菌脲可誘導意大利蜜蜂保護酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化物酶(peroxidase, POD)活性，而對保護酶過氧化氫酶(catalase, CAT)和解毒酶羧酸酯酶(carboxylesterases, CarE)、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase, GST)活性表現為低濃度誘導，高濃度抑制；而咪鮮胺對意大利蜜蜂細胞色素P450(cytochromeP450, CYP450)表現出顯著的抑制作用。在不同處理時間段內，意大利蜜蜂保護酶和解毒酶處于協調變化狀態，從而降低菌劑對蜜蜂生理的負面影響[16]。多菌靈低濃度處理可激活意大利蜜蜂體內CYP450和CarE酶的活性，但隨著處理濃度增加，多菌靈處理組中的激活效應消失。亞致死劑量的腈菌唑、丙環唑和咪鮮胺處理中華蜜蜂內勤蜂48 h后，其GST活性顯著提高，而CYP450活性顯著降低[22]。不同濃度百菌清處理中意大利蜜蜂6日齡幼蟲后，其體內CYP9Q1、CYP9Q2和GSTD1的基因表達量均顯著下調，但可誘導新出房成蜂CYP9Q2、CYP9Q3、CYP9S1、GSTD1和PKAC1的基因表達量，這表明意大利蜜蜂的幼蟲和成蜂抵御外界殺菌劑脅迫的方式存在一定的差異[37]。

2.2.2 殺菌劑對蜜蜂消化與循環系統的影響

殺菌劑進入蜜蜂的消化道和血淋巴后，影響中腸細胞和血淋巴中的血細胞及其細胞器的正常結構和生理功能，導致蜜蜂對營養物質的吸收和代謝能力下降[13]。嘧菌酯處理(100 g·L-1和200 g·L-1)可抑制意大利蜜蜂堿性磷酸酶和溶菌酶活性，引起血淋巴中漿血細胞數量下降及細胞核核異型比例增加[45]。Tadei等[46]發現，吡菌酯可導致意大利蜜蜂成蜂中腸細胞DNA片段化和Hsp70表達量增加；而吡唑醚菌酯和啶氧菌酯均可導致其中腸消化細胞和再生細胞的細胞質空泡化、分泌量增加和形態異常的現象，高濃度吡唑醚菌酯處理導致意大利蜜蜂腸道總蛋白含量下降[30]；啶氧菌酯對意大利蜜蜂馬氏管及其細胞的結構無明顯的影響，但導致細胞凋亡信號增加[47]。異菌脲處理意大利蜜蜂24 h和48 h后，其中腸消化細胞的atg1基因表達量增加，且有較多的溶酶體；同時消化細胞內質網退化、空泡化增加、頂端細胞異常突起、細胞核碎裂和染色質凝聚，Carneiro等[48]通過分析認為，異菌脲可抑制意大利蜜蜂谷胱甘肽的合成，導致活性氧的產生，進而誘導不同類型的細胞死亡。除中腸柱狀細胞外，腈菌唑和百菌清還可引起意大利蜜蜂唾液腺和卵巢細胞的凋亡，其中對柱狀細胞的影響最大，2種殺菌劑處理的平均細胞凋亡率分別為69%和55%[49]。

2.2.3 殺菌劑對蜜蜂線粒體與呼吸代謝的影響

殺菌劑影響蜜蜂細胞內的線粒體的功能，導致其體內三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)含量降低及運動和飛行能力下降，影響采集效率。吡唑醚菌酯處理意大利蜜蜂后，會導致其體內參與碳水化合物和能量代謝酶基因表達量降低，如果糖-二磷酸醛縮酶、磷酸丙糖異構酶、蘋果酸酶、6-磷酸葡萄糖異構酶、精氨酸激酶和無機焦磷酸酶等[50]，同時吡唑醚菌酯可影響線粒體呼吸過程中的膜電位(在5 μmol·L-1及以上劑量)、琥珀磷酸化(10 μmol·L-1及以上的劑量)以及ATP的合成(15 μmol·L-1及以上劑量)，且隨著處理濃度的增加抑制效果越顯著，意大利蜜蜂線粒體的功能受到擾亂，ATP合成速率降低，內勤蜂蛋白合成能力下降，采集蜂飛行活動受到影響[51]。Prado等[52]發現6種常用殺菌劑的混合物可使意大利蜜蜂腹部線粒體的核基因(mrpl-15、mrpl-49、ndufb7、tim8和tim9)表達量及采集效率顯著下降。Mao等[53]發現腈菌唑可損害意大利蜜蜂細胞內線粒體的功能，降低其體內ATP的產生，導致其飛行能力下降，同時腈菌唑也可使中華蜜蜂的呼吸速率顯著下降，且呼吸速率下降程度與處理時間成正相關[54]。百菌清可影響意大利蜜蜂呼吸代謝中的氧化磷酸化，新陳代謝以及內分泌相關基因的表達量和轉錄本發生變化，如CYP9q1、CYP9q2、CYP9q3、hbg-3和ilp-1等，導致越冬蜂大量死亡[55]。

2.2.4 殺菌劑對蜜蜂免疫系統的影響

蜜蜂自身的免疫能力決定了其應對外界病原物等不良的影響的能力，而殺菌劑可引起蜜蜂免疫能力下降，與病原物協同影響蜜蜂健康。Degrandi-Hoffman等[56]分別用啶酰菌胺和吡唑醚菌酯處理3日齡和7日齡的意大利蜜蜂工蜂后，發現其對殘翅病毒(deformed wing virus, DWV)和黑蜂王臺病毒(black queen cell virus, BQCV)免疫力下降，2種病毒的滴度增加。作為蜜蜂體液免疫的重要組成部分，溶菌酶、凝集素和酚氧化酶(phenoloxidase, PO)系統和抗菌肽等免疫因子可幫助蜜蜂應對外界不良因素的影響。苯菌靈處理意大利蜜蜂后，共有5 759個差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)表達上調，其中77個極其顯著的DEGs主要與免疫、解毒、生物代謝和調控功能相關，如免疫基因abaecin、Def1和SP2等均顯著上調；免疫信號Toll的Toll-1、Toll-6、Toll-8、Toll-10和信號傳導蛋白MyD88均表達上調被激活[57]。陳恒[39]發現多菌靈和微孢子蟲(Nosemaceranae)對意大利蜜蜂存活率無協同作用，但二者共同脅迫可影響其免疫應答，使抗菌肽基因abaecin和degensing-1表達量下調，而AmEaster和hymen表達量則顯著上調。咪鮮胺可激活意大利蜜蜂剛出房成蜂的Toll、JAK/STAT和JNK等免疫通路基因，使其體內抗菌肽基因(defensing-1和defensin-2)和解毒基因PKA-1的表達量增加[58]。百菌清可降低意大利蜜蜂體內氧化酶活性，導致意大利蜜蜂對獸棚病毒(flock house virus, FHV)抵抗力下降[36]。通過田間實驗發現，田間殘留的多菌靈能顯著降低意大利蜜蜂采集蜂的免疫基因(hymenoptaecin和apidaecin)的表達量，并導致其P450酶活性顯著下降[59]；通過室內測定分析發現，多菌靈可引起意大利蜜蜂幼蟲和成蜂體內多個DEGs表達量發生變化，其中免疫基因abaecin、defensin-1、Hymenoptaecin，酚氧化酶A3亞基(phenoloxidase subunit A3)和溶菌酶(lysozyme)的表達量均顯著上調[60-61]。這些研究結果表明殺菌劑可以直接對意大利蜜蜂的免疫基因產生影響，同時蜜蜂可協調體內其他免疫途徑來減輕殺菌劑對其免疫能力帶來壓力。

2.3 殺菌劑對蜜蜂的腸道微生物的影響

蜜蜂的腸道微生物具有構成簡單、組成穩定等特點，其對寄主的生長發育、營養代謝、提高免疫力和降解有毒物質等方面至關重要[62]。蜜蜂在取食含有殺菌劑的食物后，其體內穩定的腸道微生物多樣性、豐度和組成均能產生不同程度變化等失調現象，進而影響蜜蜂對食物營養的攝入以及免疫系統的破壞，導致蜜蜂個體死亡和蜂群崩潰[27]。代君君等[17]利用PCR-DGGE分析方法研究發現，5 mg·mL-1苯菌靈可導致意大利蜜蜂腸道真菌的種類和數量均顯著下降，造成其腸道微生態平衡失調，破壞了蜜蜂機體正常的生理功能，嚴重影響蜜蜂的健康。范榮莉[27]研究發現，不同濃度多菌靈處理(5、50、500和5 000 mg·kg-1)可擾亂意大利蜜蜂腸道微生物結構的穩定性，如厚壁菌門(Firmicutes)的Frischella屬和變形菌門(Proteobacteria)的Gilliamella屬的多樣性與豐富度均有不同程度的改變；與對照相比，多菌靈500 mg kg-1處理組的乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度顯著降低，而變形菌門豐度增加。復配劑Pristine?的低濃度處理(1.99 mg·L-1)可導致意大利蜜蜂腸道內γ-變形菌綱Gilliamellasp.相對豐度降低，且細菌種類數量下降；而高濃度處理(11.41 mg·L-1)可致乳桿菌屬類群(Lactobacillussp.)、Firm-4和Firm-5的豐度增加[40]。百菌清可引起意大利蜜蜂腸道細菌群落結構和功能發生變化，如乳桿菌科(Lactobacillaceae)的相對豐度下降，而腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和柄桿菌科(Caulobacteraceae)相對豐度提高，這導致處理組意大利蜜蜂的糖代謝過程中的氧化磷酸化增強，但腸道中肽酶的氧化磷酸化下降，進而影響蜜蜂對蛋白質的消化吸收，導致其營養不良[63]。

此外，殺菌劑和蜜蜂的病原物對其腸道微生物具有協同作用，啶酰菌胺可導致感染東方蜜蜂微孢子蟲(Nosemaceranae)意大利蜜蜂的死亡率增加，Paris等[64]研究發現啶酰菌胺田間施用濃度與微孢子蟲協同作用可改變意大利蜜蜂體內腸道微生物的多樣性，導致α-變形菌(Alphaproteobacteria)豐度降低，變形菌(Gammaproteobacteria)豐度增加，進而引起蜜蜂腸道菌群的紊亂。通過在意大利蜜蜂飼料中添加乳酸片球菌(Pediococcusacidilacticii)降低微孢子蟲和啶酰菌胺對其發育(卵黃原蛋白)、免疫(絲氨酸蛋白酶-40、防御素)和解毒(谷胱甘肽過氧化物酶-2、過氧化氫酶)等基因的負面影響[65]。

2.4 殺菌劑對蜜蜂行為的影響

為應對復雜的外界環境，蜜蜂形成了完善的勞動分工體系和多樣的行為表現，如訪花、采集、舞蹈、防御、衛生、學習和記憶等，這些行為對蜜蜂個體和群體的發展至關重要[66]。復配劑Pristine?可促進蜂群中的負責照顧蜂王和幼蟲的內勤蜂提早轉換為采集蜂，使其行為發生根本性的改變[29]。Liao等[32]研究發現，啶酰菌胺可使意大利蜜蜂振翅時間延長、振動次數減少，影響其飛行和采集能力下降，而吡唑醚菌酯可抑制3～4日齡成蜂體內ATP的合成，導致其活動能力(運動距離和速率)顯著下降[31]。丙環唑可使意大利蜜蜂過度興奮和腹部彎曲等異常行為，但隨著處理時間延長，癥狀逐漸消失[67]，而王銅和福美雙能提高意大利蜜蜂采集活動的積極性和對外的攻擊性[68]。

花蜜和花粉中殘留的殺菌劑可影響蜜蜂視覺、嗅覺、味覺和定位等能力，導致其行為的精確度和準確度出現偏差，這些行為尤其是學習記憶能力決定了蜜蜂的采集效率，一旦受到不良影響可導致蜂群中食物缺乏[69-72]。DesJardins等[69]利用不同濃度的Pristine?處理意大利蜜蜂后發現，處理組意大利蜜蜂對蔗糖的反應與對照組無差異；但處理組(23 mg·L-1和230 mg·L-1)的學習效果顯著下降，僅有80%個體能進行聯想學習，且處理組意大利蜜蜂對氣味的反應頻率也顯著低于對照。咪鮮胺不同濃度處理組(35.7、75和150 mg·L-1)意大利蜜蜂對糖水反應的靈敏度與對照組無差異，但處理組意大利蜜蜂的學習記憶能力下降[70]。部分殺菌劑還可以通過影響蜜蜂的正常生理狀態進而使其行為出現異常，殺菌劑Pristine?(230 mg·L-1)長期處理才能對其聯想學習行為有顯著影響，同時亦可導致意大利蜜蜂飛行能力及代謝率顯著下降，降低采集蜂的授粉效率和效果[71]。蜂蠟中的百菌清殘留可使意大利蜜蜂蜂王下顎腺分泌的信息素下降，導致其對蜂群中工蜂的吸引力和蜂群控制力下降[38]。除室內試驗外，大量的田間試驗也證實了殺菌劑對蜜蜂行為具有負面影響，Tschoeke等[72]發現，隨著甲基硫菌靈和百菌清使用次數的增加，意大利蜜蜂訪花頻率也會隨之下降；而嘧菌酯、腈苯唑和丙硫菌唑也對蜜蜂的有不同程度驅避作用。與對照相比，殺菌劑混合使用導致采粉蜂的數量下降43%[73]。商品藥劑Horizon(有效成分為戊唑醇)不同濃度處理(250、125和62.5 g·L-1)對意大利蜜蜂具有一定的驅避作用，驅避率均高于90%[74]。

3 殺菌劑與其他農藥對蜜蜂的聯合毒性效應(Combined toxic effects of fungicides with other pesticides to bees)

大多數殺菌劑單獨使用對蜜蜂低毒或無毒，但殺菌劑可以通過影響蜜蜂解毒酶活性，能量代謝等正常的生理代謝，提高農藥對蜜蜂毒性，其中殺菌劑對殺蟲劑的增效作用的研究較多，二者聯合暴露后會提高殺蟲劑的毒性，導致蜜蜂死亡率增加。氟醚唑可使聯苯菊酯、l-氯氟氰菊酯、β-氯氟氰菊酯、z-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、γ-氯氰菊酯、氯菊酯和氰戊菊酯等8種菊酯類殺蟲劑對意大利蜜蜂急性毒性提高1.61倍～5.45倍[61]。丙環唑可提高氯蟲苯甲酰胺、除蟲脲和甲氧蟲酰肼對意大利蜜蜂的毒性，還可導致蜂蛹羽化率顯著下降[75-76]。甲基硫菌靈、百菌清及二者混合物可使吡蟲啉對意大利蜜蜂急性毒性提高了23.9倍、126倍和1 589.8倍[77]。咪鮮胺可提高氟胺氰菊酯(1 980倍)、蠅毒磷(70.9倍)和唑螨酯(26.6倍)對意大利蜜蜂的毒性[78]。殺菌劑和其他農藥的混合物也會對蜜蜂個體和蜂群產生累積和聯合作用，嚴重威脅蜜蜂個體和群體的健康。苯醚甲環唑與吡蟲啉、草甘膦的混合物可導致越冬意大利蜜蜂食物消耗量增加，但蜂群存活率卻顯著下降[79]。Han等[80]研究發現丙環唑可提高啶蟲脒對中華蜜蜂的毒性，還可使剛出房中華蜜蜂和采集蜂的體質量顯著下降、P450和GST酶活改變，二者對中華蜜蜂成蜂具有顯著的協同增效作用。多菌靈與噻蟲嗪混合處理可導致意大利蜜蜂的嗅覺能力下降，不能區分花香，對蜜粉源植物定位時間有所延長，導致采集蜂工作效率下降[81]。Zhu等[82]研究發現四氟醚唑和吡蟲啉混合處理意大利蜜蜂，處理組成蜂CarE、GST、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)和酚氧化酶(PO)的活性增強。與單獨唑菌胺酯處理相比，唑菌胺酯與氟蟲腈的混合物連續處理意大利蜜蜂內勤蜂6 d，可導致其上顎腺分泌細胞體積和咽下腺腺泡數量下降，進而影響蜂王漿的分泌量[83]。Domingues等[84]通過對血淋巴內的血細胞檢測發現，啶氧菌酯與噻蟲嗪混合處理可使意大利蜜蜂成蜂絳色細胞的形狀和大小及心包細胞活動出現異常，影響意大利蜜蜂的正常營養吸收，且處理組血淋巴中營養物質含量下降，成蜂壽命縮短、死亡率增加。咪鮮胺和蠅毒磷混合處理可顯著降低意大利蜜蜂的預蛹的體內病原識別蛋白(PGRP-SC、PGRPSC 4300和PGRPLC 710)和免疫基因(defensing-1和abaecin)的表達量，而白眼蛹的JNK(basket)、Toll(cactus和toll)和AMP(abaecin、defensin-1和defensin-2)等相關免疫基因的表達量增加[85]。

4 總結與展望(Summary and prospect)

據國際殺菌劑抗藥性行動委員會(Fungicide Resistance Action Committee, FRAC)報道，殺菌劑的作用機理涉及到病原菌生理、生化及相關代謝各方面，如：物質(核酸、氨基酸、蛋白質、脂類和甾醇等)合成、呼吸作用、酶的活性、信號轉導和物質運輸等；這些作用靶點亦普遍存在各類生物體內(表1)[13]。對于非靶標生物蜜蜂而言，殺菌劑施用后會直接或間接進入其體內，在解毒保護機制(解毒酶和保護酶)的作用下被降解并排除體外，所以大多數的殺菌劑對蜜蜂的急性經口毒性均為低毒[19]，如甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑。該類殺菌劑作用機理是影響病原菌線粒體復合物Ⅲ輔酶Q的氧化位點(Qo)結合，阻斷細胞色素b和c1間的電子傳遞，從而干擾細胞正常的ATP的合成[86]；但意大利蜜蜂長期接觸后會影響其線粒體呼吸過程中的膜電位、琥珀磷酸化及ATP的合成，導致蜜蜂的活動能力下降，且隨著處理濃度的增加抑制效果越顯著[31,51]；同時還會導致工蜂腸道總蛋白含量下降，中腸消化細胞和再生細胞形態異常，細胞質空泡化增加的現象。此外，該類殺菌劑對非靶標水生生物斑馬魚具有較高的毒性，導致其畸形率增加并影響能量合成、氧化應激、細胞凋亡及內分泌干擾相關基因的表達[86-87]。因此長期在低濃度殺菌劑暴露亦會對非靶標生物產生慢性毒性，對其生長發育、生理和行為等方面產生毒性效應[86]。在生產實踐中，應加強對殺菌劑施用的監管，并通過限制其施用劑量、施用范圍等措施以降低其對非靶標生物和環境的影響。

目前，多數研究均基于殺菌劑對蜜蜂的致死中濃度(median lethal concentration, LC50)或致死中劑量(median lethal dose, LD50)，評估其對蜜蜂的毒性，并測定此殺菌劑濃度或者劑量對蜜蜂存活率、食物消耗、飛行、定向歸巢、學習記憶、繁殖、生理功能、與病原互作等諸多方面有影響。在實際生產中，殺菌劑的田間施用濃度或者劑量遠低于其對蜜蜂的致死中濃度(LC50)或致死中劑量(LD50)，蜜蜂接觸殺菌劑后對其存活率無顯著影響，但亞致死劑量或濃度的殺菌劑對蜜蜂等傳粉昆蟲的生長發育、生理和行為等方面仍具有潛在的威脅，這方面研究應是今后蜜蜂毒理學研究的重點之一。為更精確地評估殺菌劑對蜜蜂的影響，應當在室內測定殺菌劑對蜜蜂急性毒性(經口和接觸)的基礎上，注重半田間或田間實驗以及幼蟲飼喂試驗，通過初級評估(風險商值，RQ)和高級風險評估進行殺菌劑特征描述，以確保殺菌劑使用不會對蜜蜂個體和種群造成長期的不良影響[88]。此外，在殺菌劑對蜜蜂影響研究中的研究對象多為意大利蜜蜂，而中華蜜蜂、熊蜂(Bombusterrestris、B.impatiens)、壁蜂(Osmiacornifrons、O.bicornis、O.lignaria)、切葉蜂(Megachilerotundata)以及其

表1 我國蜜粉源植物上登記使用的殺菌劑的種類、通用名及作用機理Table 1 Classification, common name and action mechanism of registered fungicides on nectar and pollen plants in China

他野生傳粉蜂的研究相對較少。未來應該注重開展常用殺菌劑對這些蜂類的毒性、作用機理和亞致死效應方面的研究，這對于我國授粉蜂類種質資源和多樣性保護策略的制定具有重要的參考價值。此外，在制定作物的綜合防控策略時，應該考慮防治措施對傳粉昆蟲，天敵昆蟲等有益生物的影響，使用對環境友好的生物農藥，合理使用化學農藥；建立并推廣蜜蜂授粉與綠色防控技術體系，保障蜜蜂等授粉昆蟲的福利，將有害生物綜合治理(integrated pest management, IPM)轉換為有害生物和授粉昆蟲的綜合管理(integrated pest and pollinator management, IPPM)[89]，促進我國養蜂業、授粉業和農業的健康可持續發展。