鎘對集胞藻光合活性的影響

阮港，許萍萍，殷旭旺，張春梅，宋高飛，米武娟，畢永紅,*

1. 大連海洋大學水產與生命學院，大連 116023 2. 中國科學院水生生物研究所，淡水生態與生物技術國家重點實驗室，武漢 430072

鎘是一種生物半衰期相對較長的非必需重金屬元素，容易在生物體中積累并行使生理功能[1]，具有高致毒性[2]；如鎘與巰基緊密結合，是一種酶抑制劑[3]，破壞細胞內部離子平衡并與蛋白質中的金屬離子發生置換反應導致其失去活性[4]；鎘激發細胞的氧化應激造成脂質過氧化、引起蛋白質/DNA損傷[5]；鎘還可通過干擾DNA合成與修復，破壞細胞的增殖和分化、細胞周期進程和細胞凋亡等[6]。即使在較低濃度下，鎘也能通過誘導氧化應激和影響生長、代謝、營養吸收、光合作用和呼吸作用對光合生物產生毒害效應[7-9]。鎘對藻類的毒性試驗表明，鎘脅迫能顯著抑制柵藻生長并破壞細胞超微結構[2]；鎘對藻類光合系統具有毒性效應，破壞葉綠素合成[10-12]，競爭性結合放氧復合體(OEC)上Ca2+位點和葉綠素a的Mg2+等[13]。長期以來，鎘被認為是沒有任何有益功能的有毒重金屬。但最近研究表明，植物需要微量Cd2+才能達到最佳生長狀態[14]；在硅藻中，金屬鎘、鈷和鋅可以在功能上互相替換，以保持最佳的生長速度[15]?？梢?，鎘的確切生物效應仍不甚明了，需要深入研究。

藍藻作為水生生態系統總初級生產力的重要貢獻者，是重金屬進入食物鏈的主要途徑之一；暴露在環境中的藍藻細胞對重金屬脅迫敏感，集胞藻作為光合作用研究的模式生物，是研究水體重金屬潛在生態風險的重要模型[16]。盡管Cd2+對藻細胞光合系統影響的研究已非常深入，但此前的研究主要集中在藻細胞對重金屬脅迫的生理響應和生物吸附能力[17-21]，Cd2+的毒性機制仍不明確，且Cd2+的急性毒性脅迫影響光合系統中的位點存在一些相互矛盾的結果[10, 22]，例如，PSⅠ和PSⅡ對鎘的敏感性存在爭議；Cd2+的脅迫位點位于電子傳遞鏈的確切部位存在分歧。本文選擇集胞藻PCC 6803為對象，探究不同濃度Cd2+對細胞抗氧化酶系統和光合活性的毒性效應，以期尋找Cd2+作用于藍藻細胞的靶標位點，進一步認識重金屬對淡水藍藻的毒性作用及其急性致毒機理、評估重金屬的生態風險提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料和培養條件

集胞藻(Synechocystissp.)PCC 6803來自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB-collection)。以改良BG11培養基(不含EDTA)為培養液，在(30±1) ℃、30～40 μmol·m-2·s-1持續光照條件下，以130 r·min-1轉速進行搖床培養，采用紫外分光光度計(UV1701，日本島津)測定培養物在730 nm的吸光值，通過A730 nm監測其生長。初始接種濃度A730 nm=0.1接入250 mL三角瓶，收集處于對數生長期(A730 nm=0.8～1.0)的藻細胞用于本研究。

3 000 r·min-1轉速離心5 min收集對數生長期的藻細胞，無菌水沖洗3次后，置于BG11培養基中，接種量少于培養基的1%，接入含有100 mL BG11的三角瓶。分析純的試劑CdCl2·2.5H2O購于中國國藥有限公司。設置各處理組中Cd2+濃度分別為0.05、0.25、0.50和1.00 mg·L-1，以0 mg·L-1作為對照組。每個濃度設置3個重復，試驗周期為24 h。

1.2 指標測定

1.2.1 光合色素含量的測定

光合色素含量的測定如前人[23]描述，取5 mL培養物4 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，加入5 mL預冷的90%的甲醇，混勻后在4 ℃冰箱避光提取24 h，4 000 r·min-1離心10 min后，取上清液，采用紫外分光光度計測定665、652和470 nm波長的吸光值，參照公式計算葉綠素a(Chla)和類胡蘿卜素(Car)的含量：

Chla(mg·L-1)=16.82A665-9.28A652

Car (mg·L-1)=(1000A470-1.91Chla)/225

1.2.2 活性氧(ROS)含量測定

集胞藻細胞內的ROS用二氯二氫熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)檢測。DCFH-DA能進入細胞內，被酯酶分解為DCFH，DCFH與H2O2等小分子過氧化物結合而被氧化成具有熒光性的DCF。在24 h取樣，離心，重懸于100 mmol·L-1PBS (pH 7.2)緩沖液中，再使用PBS緩沖液洗滌細胞2次，200 mL培養物加入96孔板用酶標儀(PerkinElmer VICTOR Nivo，美國)檢測DCF熒光強度(激發波長485 nm和發射波長530 nm)和葉綠素熒光(激發波長485 nm和發射波長670 nm)。使用葉綠素熒光法歸一化單個細胞ROS含量，使用公式FDCF/FChl計算相對ROS豐度。

1.2.3 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性測定

取適量藻液4 000 r·min-1離心10 min后，將藻泥懸浮于1 mL生理鹽水(0.9% NaCl)，加入適量鋯珠，4 ℃冷凍破碎，4 ℃、1 800 r·min-1離心10 min，取上清用于蛋白含量與酶活測定。SOD的測定使用試劑盒(南京建成)，蛋白質測定使用微孔BCA蛋白試劑盒WST-1法(康為世紀)，使用蛋白量歸一化SOD含量。

1.2.4 快速熒光誘導動力學曲線(OJIP)和PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)的檢測

OJIP曲線和Fv/Fm使用AquaPen-C AP-C 100熒光儀 (Photon Systems Instruments，Brno，捷克)測定，其中Fv=Fm-F0，F0和Fm分別是藻細胞在暗適應狀態下的最小和最大熒光產量[24-25]。調節合適的細胞濃度，室溫暗適應10 min，藍藻F0的測定使用弱藍色測量光(450 nm，<0.1 μmol·m-2·s-1)，該光強不足以引起光化學電子傳遞，Fm采用飽和脈沖光(1 800 μmol·m-2s-1)照射800 ms測得。以照射時間為橫坐標，熒光強度為縱坐標，對快速葉綠素熒光誘導動力學曲線作圖，為了更好地觀察J點和I點，把橫坐標改為對數坐標，結果得到OJIP誘導曲線。

Ft=A1exp(-t/T1)+A2exp(-t/T2)+A3exp(-t/T3)+A0

式中：Ft代表可變熒光產量，A0～A3指幅度，T1～T3是時間常數，半衰期由時間常數T計算得來，公式t1/2=ln 2T。

1.2.6 S-state檢測

取3 mL待測樣品放入樣品室，打開測量光測定F0，測量光照射時間是1 ms。隨后打開光化光閃光照射樣品，光化光閃光次數為10次，每次閃光時間間隔為100 ms。以照射時間為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖即為S-state曲線[29]。根據S-state曲線，無活性PSⅡ反應中心(PSⅡX)比例可通過F0第4次光化光閃光后100 ms處熒光值的差值進行估算，具體計算公式為：ΔF4=F400 ms/F0-1。由于本試驗中相對可變熒光強度降低，使用修改后公式[30]來計算PSⅡX的比例：PSⅡx(%)=ΔF4×100(F300 ms/F0-1)。

1.3 數據分析

本試驗各組均設置3個平行。統計軟件使用SPSS25.0(IBM，USA)，處理組和對照組間采用單因素方差(One-way ANOVA)分析檢驗，若差異顯著進行最小顯著差異(LSD)多重比較檢驗組間差異顯著性。繪圖和數據處理使用R語言中的tidyverse包。

2 結果(Results)

2.1 光合色素含量變化

不同濃度Cd2+對葉綠素a含量影響如圖1所示。0.05 mg·L-1濃度處理后，葉綠素a與對照組相比呈現上升趨勢；以0.25、0.50和1.00 mg·L-1處理集胞藻后，葉綠素a含量與對照組相比顯著下降(P<0.01)。

圖1 不同濃度鎘離子處理24 h對集胞藻光合色素含量的影響注：*表示與對照組相比存在顯著性差異。Fig. 1 Effect on the pigment content in Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 hNote: *indicates significant difference compared with the control group.

2.2 ROS含量和SOD活性變化

如圖2所示，處理24 h后，Cd2+濃度0.05 mg·L-1處理組與對照組相比ROS含量顯著上升(P<0.01)，Cd2+濃度為0.25、0.50和1.00 mg·L-1的處理組ROS含量分別是對照組的1.47倍、2.58倍和2.69倍。

圖2 不同濃度鎘離子處理24 h集胞藻活性氧(ROS)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化注：*表示與對照組相比存在顯著性差異。Fig. 2 Change of reactive oxygen species (ROS) content and superoxide dismutase (SOD) activity in Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 hNote: *indicates significant difference compared with the control group.

與對照組相比，Cd2+濃度為0.05、0.25和0.50 mg·L-1的處理組藻細胞中SOD活性顯著上升(P<0.05)；Cd2+濃度為1.00 mg·L-1的處理組藻細胞中SOD活性與對照組差異不顯著(P>0.05)。

2.3 葉綠素熒光活性的變化

集胞藻在不同Cd2+環境中，葉綠素熒光誘導曲線和PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)如圖3和圖4所示。由圖3可知，Cd2+濃度為1.00 mg·L-1，P峰消失。歸一化的OJIP曲線可以更好比較各峰之間的變化；Cd2+濃度0.50 mg·L-1，J峰顯著上升(P<0.01)。由圖4可知，Cd2+濃度為0.50 mg·L-1和1.00 mg·L-1，處理組Fv/Fm相對于對照組顯著下降(P<0.01)。

圖3 不同濃度鎘離子處理24 h集胞藻的OJIP曲線注：相對可變熒光計算公式為Vt=(Ft-F0)/(Fm-F0)。Fig. 3 OJIP fluorescence transients of Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 hNote: Relative variable fluorescence is calculated by Vt=(Ft-F0)/(Fm-F0).

圖4 不同濃度鎘離子處理24 h集胞藻的PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)變化注：*表示與對照組相比存在顯著性差異。Fig. 4 Change of PSⅡ maximum photochemical efficiency (Fv/Fm) in Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 hNote: *indicates significant difference compared with the control group.

2.4 Cd2+對再氧化的影響

圖5 不同濃度鎘離子處理24 h集胞藻再氧化曲線注：熒光強度計算公式為Ft-F0。Fig. reoxidation kinetic curves of Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 hNote: Fluorescence intensity is calculated by Ft-F0.

表1 不同濃度鎘離子處理24 h集胞藻的再氧化曲線參數Table 1 Parameters of reoxidation kinetics in Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 h

2.5 Cd2+對無活性PSⅡ反應中心(PSⅡX)的影響

不同濃度Cd2+作用下連續單飽和反轉閃光激發后S-state曲線如圖6(a)所示。PS Ⅱ反應中心的一部分不能將電子從初級受體QA傳遞給次級受體QB，成為PSⅡX。據此計算細胞內的PSⅡX的比例的結果如圖6(b)所示，Cd2+濃度為0.50 mg·L-1和1.00 mg·L-1，集胞藻PSⅡX比例顯著上升。

圖6 不同濃度鎘離子處理24 h集胞藻熒光衰減曲線(a)和無活性PSⅡ反應中心(PSⅡX)比例(b)的變化注：*表示與對照組相比存在顯著性差異，熒光強度計算公式為Ft/F0。Fig. 6 Fluorescence decay curves (a) and the proportion of inactive PSⅡ reaction center (PSⅡX) (b) of Synechocystis sp. after exposure to different concentrations of cadmium for 24 hNote: *indicates significant difference compared with the control group, and fluorescence intensity is calculated by Ft/F0.

3 討論(Discussion)

盡管地殼中鎘元素含量很低，但人類通過采礦、有色金屬冶煉和肥料生產使其濃度在局部環境中增加到有毒水平，如化工園區或密集種植區土壤中的Cd2+濃度達到100 mg·kg-1以上。這些Cd2+最終匯集到江河湖海中，威脅水域生態系統的安全與健康。藍藻作為水域生態系統的重要成員，對鎘具有較強的吸附/吸收能力；研究表明藍藻細胞能在30 min吸附70%以上Cd2+，胞內聚集的Cd2+抑制葉綠素合成并破壞類囊體膜蛋白結構，可直接或間接損傷電子傳遞系統、酶活和光合系統，進而降低藍藻細胞的光合能力；可見，藍藻細胞對Cd2+的脅迫極為敏感[22]。不高于0.50 mg·L-1的低劑量鎘濃度能夠激發集胞藻細胞的氧化應激和抗氧化酶系統，該結果與曲殼藻[31]暴露在鎘脅迫中的表現基本一致。本試驗也發現，鎘脅迫對細胞光合系統造成損傷，破壞光合電子傳遞鏈導致電子外溢，胞內的氧與外溢電子結合產生ROS[32]；鎘離子含量的增加會導致ROS的產生量持續增加，引起胞內ROS聚集；過量的ROS導致亞細胞結構的破壞，并使其他酶失活，破壞色素和光合系統，導致藻細胞光合作用和其他代謝過程發生紊亂[33-34]。為了應對鎘脅迫產生的ROS氧化壓力，細胞合成SOD消除ROS的毒性效應；這使得SOD酶活性應激性增強。

Cd2+會直接影響藻細胞的色素成分和生長增殖[7, 37-40]，本研究發現，0.25、0.50和1.00 mg·L-1Cd2+處理集胞藻時，其葉綠素含量受到顯著抑制。該結果與已有文獻的研究結果類似[26, 41]。另一方面，本試驗0.05 mg·L-1的Cd2+能促進集胞藻葉綠素的合成。與之前的研究結果“低濃度Cd2+(0.1 mmol·L-1)能促進集胞藻生長和葉綠素合成”[38]，導致蛋白質合成以及細胞中可溶性糖含量增多[23]等類似；這些結果均表明集胞藻能夠耐受一定濃度的Cd2+。推測該現象為“毒性興奮效應”，低毒性能激發藻細胞的代謝能力，促進藻細胞大分子的合成。綜合以上分析，集胞藻能耐受不高于0.25 mg·L-1的Cd2+濃度脅迫，高濃度的Cd2+對集胞藻生長具有顯著抑制作用。