小球藻(Chlorella vulgaris)耐受短期模擬酸雨及紫外輻射的光合生理特性研究

楊雨玲，章鵬，李亞鶴，蔡飛，畢淑峰，李偉,*

1. 寧波大學海洋學院，寧波 315211 2. 黃山學院生命與環境科學學院，黃山 245041 3. 黃山學院新安江流域生態環境保護研究中心，黃山 245041 4. 黃山市屯溪區林業局，黃山 245041

浮游植物作為內陸水域生態系統中初級生產力的重要組成，是構成食物網的基礎，在生物地球化學循環中扮演重要角色。環境因子如何影響、調節浮游植物的光合生理、初級生產、種群結構及豐度是生態學研究的重要內容。因空間位置(經、緯度)、水體類型(湖泊、河流)、局域環境條件的不同，影響浮游植物光合生理、群落結構的主要環境因子在不同流域存在一定差異。

黃山市是世界文明的生態旅游城市，同時也是我國受酸雨影響較大的城市之一(可參見歷年的《中國生態環境狀況公報》)。酸雨引起的水體酸化是影響新安江流域浮游植物的重要脅迫因子。水體酸化可影響浮游植物色素含量[1-2]、增加耐酸性基因表達[3]、影響光合生理過程、抑制生長，進而影響群落結構組成[4-5]。前期的研究表明，新安江流域浮游植物多樣性及豐度在短期酸脅迫下整體呈降低趨勢，且不同門類浮游植物的敏感性不同[6]，這可能與種間/株系間差異性有關[7]。

淡水水體因溶解有機質含量、水體pH值等因素的影響，水體透光率存在較大差異，從而使到達水體的光質及光強發生改變。對浮游植物光合作用及初級生產過程來說，陽光光譜中可見光(P，400～700 nm)與紫外光(UVR，包括320～400 nm紫外線A(UVA)和280～320 nm紫外線B(UVB))是最為重要的部分。作為水質全年總體較優(Ⅰ類或Ⅱ類以上占比較高)的水系(濁度較低)[8-9]，長期酸雨背景下將進一步提高水體透明度，從而增加可見光(P)及紫外輻射(UVR)在水中的強度與透射深度。UVR可單獨或與高光強耦合降低浮游植物的光合速率[10]，抑制營養鹽吸收[11-12]，誘導細胞DNA、RNA突變以及活性氧自由基的產生[13-14]，導致生產力的降低[12]。針對新安江流域(屯溪段)浮游植物群落結構與環境因子的研究也表明，陽光輻射尤其是UVR(UVA和UVB)為調控浮游植物豐度的重要因子[9]。

黃山市境內新安江流域為我國首個跨省生態補償試點區，具有重要生態意義與示范作用。在我國重要河流、湖泊水質逐步好轉這一背景下，酸雨脅迫與UVR耦合對浮游植物生理、生態過程的影響，在未來將是我國淡水生態系統面臨的重要環境問題之一。雖然在一定時期內酸雨不會導致水體pH值降低至酸雨臨界點(pH值5.65)或更低的水平，然而，長期、持續酸脅迫下，伴隨水體酸堿緩沖能力(acid-neutralizing capacity, ANC)的降低，流域水體在未來將面臨低pH的脅迫。因此，研究酸雨脅迫如何與UVR耦合影響新安江流域水體初級生產者，是亟需探討的重要科學問題。前期的調查表明綠藻門為新安江流域主要優勢門類(硅藻門、藍藻門次之)[6, 9]，小球藻作為新安江流域重要優勢種類，出現頻率高、豐度占比高[9]。本研究選取流域分離獲得的一株小球藻(Chlorellavulgaris)為對象，通過模擬實驗，研究了該種生長及光合活性對短期模擬酸雨脅迫引起的水體pH值降低的響應，并探討了水體酸化與短期UVR的耦合效應。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 藻種及培養條件

本實驗所用小球藻(Chlorellavulgaris)于2013年7月分離自安徽省黃山市休寧縣汊口鄉一小型人工水池。藻種使用BG-11(+N)培養基進行培養，并長期保種于光照培養箱內，溫度為20 ℃，光照強度為60 μmol·m-2·s-1，光暗比(L∶D)為12 h∶12 h。

1.2 實驗方法

1.2.1 模擬酸雨母液制備及培養基pH值測定

人工調配質量分數為98%的濃硫酸(國藥集團化學試劑有限公司)與質量分數為65%的濃硝酸(國藥集團化學試劑有限公司)，按物質的量比為8∶1制備模擬酸雨母液(黃山地區以硫酸型酸雨為主)。通過向培養基中加入不同體積的模擬酸雨母液，分別獲得pH值為5.65和4.50的模擬酸雨培養基，正常培養基使用1 molL-1的HCl和NaOH調節pH值為7.10作為對照組。模擬酸雨制備過程中使用Mettler Toledo DL15 Titrator(瑞典)對pH值進行測定，測定前使用National Bureau of Standards(NBS)緩沖液對pH計進行校正。

1.2.2 模擬酸雨處理及細胞粒徑、比生長速率(μ)的測定

通過向已調節好pH值(7.10、5.65和4.50)的培養基中加入指數生長期的藻細胞，調節細胞濃度至約1.0×105個mL-1，于體積為1 L的聚碳酸酯瓶(PC)中培養，每個處理下3個重復培養。將上述不同pH處理的小球藻藻體置于高(150 μmol·m-2·s-1)、低(60 μmol·m-2·s-1，即培養光強)光強下進行短期培養(24 h)，光暗比(L∶D)為12 h∶12 h，培養溫度為20 ℃。使用顆粒計數儀(Z2, Beckman，美國)測定上述條件下培養24 h后的細胞濃度及細胞粒徑，并對各處理下的pH值進行測定獲得其變化情況。

比生長速率(μ)的計算使用公式：

μ(h-1)=(lnNA-lnNB)/t

式中：NA為各處理下培養24 h(t)后的細胞濃度(個·mL-1)，NB為初始接種的細胞濃度(個·mL-1)。

1.2.3 色素的提取和測定

各pH值處理24 h后，將一定體積的藻液經GF/F濾膜(0.7 μm, Whatman)過濾，置于離心管內并加入5 mL甲醇，4 ℃條件下過夜提取，于離心機內5 000g下離心10 min，分光光度計(Beckman DU-800，美國)下測定200～750 nm吸光值(Anm)。葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)及類胡蘿卜素(carotenoid)的測定方法參照Wellburn[15]，紫外吸收物質(MAAs)的測定依據提取液上清吸收光譜在334 nm處的吸收峰高度(HOD)[16]，以HOD與Chla的比值獲得，各種色素的具體計算方法如下：

Chla(μg·mL-1)=15.65×(A666-A750)-7.34×(A653-A750)

Chlb(μg·mL-1)=27.05×(A653-A750)-11.21×(A666-A750)

Carotenoid (μg·mL-1)=(1000×(A470-A750)-2.86×Chla-129.2×Chlb)/221

MAAs (HOD·ng-1)=H/Chla

1.2.4 紫外輻射處理

將上述不同pH值、高低光強下培養24 h后的小球藻置于35 mL石英管內，通過在石英管外包裹不同的濾光膜獲得2種輻射處理，即只有可見光輻射(P)(Ultraphan 395濾膜，UV Opak，Digefra，德國)，或者全波段輻射(PAB，可見光+紫外線A+紫外系B)(Ultraphan 295濾膜，UVOpak，Digefra，德國)。本研究輻射處理使用太陽模擬器(Sol 1200 W，A. G. H?nle，Martinsried，德國)進行，該光源可獲得穩定的輻射處理，其中P的強度為87.5 W·m-2，UVA的強度為33.5 W·m-2，UVB的強度為1.91 W·m-2(參考我國南方地區夏季UVB輻射強度設置)。

1.2.5 葉綠素熒光參數測定

葉綠素熒光參數使用Xe-PAM(Walz，德國)進行測定。小球藻經不同pH處理0、0.5、1、3、8、20和24 h后，對其有效光化學效率(Yield)進行時間序列測定。轉移至陽光模擬器下進行短期輻射處理，測定經P和PAB輻射處理1 h后的Yield和光響應曲線。光響應曲線共設置8個光強梯度，即0、156、226、337、533、781、1 077、1 593和2 130 μmol·m-2·s-1，其中飽和脈沖強度為5 000 μmol·m-2·s-1，持續時間為0.8 s。

Yield的計算公式為：

Yield=(F’m-F)/F’m

式中：Yield為光系統Ⅱ的有效光化學效率，F為光適應下的實際熒光值，F’m為光適應下的最大葉綠素熒光。

光響應曲線相對電子傳遞速率(rETR)通過以下的公式計算：

rETR=Yield×0.5×PFD

式中：0.5代表光系統Ⅱ吸收的光量子占總量的50%，PFD為光化光的強度(μmol·m-2·s-1)。

快速光響應曲線的擬合參照Jassby和Platt[17]的方法，使用如下公式進行：

Y=rETRmax×tanh (α×x/rETRmax)

式中：x表示為光強，Y為rETR。

通過擬合可獲得相對最大電子傳遞速率(rETRmax)、光能利用效率(α)，以rETRmax與α的比值計算得到飽和光強(Ik)。

經陽光模擬器下處理后，相對于初始狀態的Yield，由P以及PAB導致的抑制率，計算方式如下：

式中：InhP、InhPAB表示在陽光模擬器下經P和PAB輻射處理1 h后相對于PInitial(初始Yield值)的抑制率，PP和PPAB表示P和PAB下1 h后的Yield值。

1.2.6 數據統計分析

不同pH值處理之間的顯著性使用one-way ANOVA(Turkey)分析；培養光強、pH值以及輻射處理兩兩之間以及三者之間的交互效應使用Two/Three-way ANOVA分析(P<0.05)。數據處理及分析使用Prism 9.0和SPSS 26.0軟件進行。

2 結果(Results)

2.1 培養體系pH值變動情況

相對于初始pH值，經24 h培養后，各處理下pH值均有一定升高，高光(HL)下pH值7.10、5.65和4.50處理，pH值分別升高了4.74%、9.20%和4.30%，低光(LL)下分別升高了3.19%、7.49%和2.59%(表1)。

表1 不同處理下初始和培養24 h后的pH值Table 1 pH values at the beginning and after 24 h culture under different treatments

2.2 細胞粒徑及比生長速率(μ)

多因素方差分析表明，pH值處理對小球藻的μ產生顯著影響(P<0.05)。pH 5.65下，低光處理與對照組μ無顯著差異，高光處理μ顯著升高了79.6%(P<0.05)(圖1(a))；較低的pH值(4.50)細胞出現負增長，相對于pH值7.10處理，高、低光強下分別降低了223%(P<0.05)和225%(P<0.05)(圖1(a))。

圖1 小球藻經正常pH值(7.10)以及模擬酸雨脅迫(pH值5.65和4.50)處理，轉移至高光(150 μmol·m-2·s-1)和低光(60 μmol·m-2·s-1)下培養24 h后的比生長速率(μ)(a)和平均細胞粒徑(b)(n=3)Fig. 1 Specific growth rate (μ) (a) and mean cell size (b) of Chlorella vulgaris cultured under high (150 μmol·m-2·s-1) and low (60 μmol·m-2·s-1) light conditions for 24 h in control pH (7.10) and acid stress treatments (pH 5.65 and 4.50) (n=3)

多因素方差分析表明，光強與pH值處理均單獨或交互對細胞粒徑產生顯著影響(P<0.05)。各pH值處理下高、低光強間細胞粒徑無顯著差異(P>0.05)；相較于對照組(7.10)，低pH值下(4.50)細胞粒徑在高光培養下顯著降低了5.5%(P<0.05)，低光下各pH值處理間無顯著差異(P>0.05)(圖1(b))。

2.3 色素含量變化

多因素方差分析表明，光強而非pH值對光合色素(葉綠素a、b)及光保護色素(類胡蘿卜素)含量產生了顯著影響(均P<0.05)；光強與pH值協同對葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量無顯著交互效應(均P>0.05)(圖2)。不同pH值處理24 h后，高光強培養的藻體，單位細胞的葉綠素a(圖2(a))、葉綠素b(圖2(b))都顯著低于低光培養的藻體(P<0.05)；類胡蘿卜素含量在高、低光強處理間無顯著差異(P>0.05)(圖2(c))；高光強下，類胡蘿卜素與葉綠素a的比值顯著高于低光處理組(P<0.05)(圖2(d))；MAAs在高、低光強下無顯著差異(P>0.05)(圖2(e))。高、低光強處理下，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、類胡蘿卜素與葉綠素a的比值以及MAAs在各pH值處理間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 小球藻經正常pH值(7.10)以及模擬酸雨脅迫(pH值5.65和4.50)處理，轉移至高光(150 μmol·m-2·s-1)和低光(60 μmol·m-2·s-1)下培養24 h后的葉綠素a(a)、葉綠素b(b)、類胡蘿卜素(c)、類胡蘿卜素與葉綠素a的比值(d)以及三苯甲咪唑類氨基酸(MAAs)(e)(n=3)注：MAAs的濃度以單位葉綠素a的質量計。Fig. 2 Chlorophyll a (a), chlorophyll b (b), carotenoid (c), the ratio of carotenoid to chlorophyll a (d) and mycosporinie-like amino acids (MAAs) (e) of Chlorella vulgaris cultured under high (150 μmol·m-2·s-1) and low (60 μmol·m-2·s-1) light conditions for 24 h in control pH (7.10) and acid stress treatments (pH 5.65 and 4.50) (n=3)Note: The concentration of MAAs is expressed as mass per unit Chl a.

2.4 有效光化學效率(Yield)及快速光響應曲線

經模擬酸雨處理后，對各處理下藻體Yield進行時間序列測定。相對于初始Yield，高、低光強下藻體Yield隨處理時間的增加都呈增加趨勢(圖3)。高光培養下，相對于pH值7.10處理，低pH值處理(4.50)的藻體，Yield隨時間呈先升高后降低趨勢，經模擬酸雨處理8、20和24 h后，Yield相對于pH值7.10處理顯著降低了6.77%、4.69%和2.61%(P<0.05)(圖3(a))；低光處理下，各pH處理間在一系列時間序列下都無顯著性差異(P>0.05)(圖3(b))。多因素方差分析顯示，不同培養光強對各pH值處理下藻體Yield具有顯著影響(P<0.05)。對比高、低光強處理各pH值下的Yield，整體上低光培養的藻體具有高的Yield(圖3(a)和圖3(b))。

圖3 小球藻經正常pH值(7.10)以及模擬酸雨脅迫(pH值5.65和4.50)處理，轉移至高光(150 μmol·m-2·s-1)(a)和低光(60 μmol·m-2·s-1)(b)下培養24 h過程中的有效光化學效率(Yield)(n=3)Fig. 3 The effective quantum yield (Yield) of control pH (7.10) and acid stress (pH 5.65 and 4.50) treated Chlorella vulgaris during the 24 h culture under high (150 μmol·m-2·s-1) and low (60 μmol·m-2·s-1) light intensity (n=3)

置于陽光模擬器下輻射處理1 h后，與培養光強相比，Yield在各pH值下都顯著受到抑制，且抑制程度在PAB處理下更高(P<0.05)(圖4)。多因素方差分析表明，培養光強、輻射處理(P、PAB)以及pH處理都顯著影響了藻體的Yield(P<0.05)，且培養光強、輻射處理及pH處理兩兩之間以及三者之間對Yield均產生了交互影響(P<0.05)。高光培養下的藻，相對于pH值7.10處理，在pH值4.50下經P、PAB輻射處理后，Yield顯著降低了14.3%(P<0.05)和21.4%(P<0.05)(圖4(a))；而低光下培養的藻，經陽光模擬器下輻射處理后(PAB)，Yield在低pH值(5.65、4.50)下整體低于高光處理組，相較于pH值7.10處理，pH值4.50下Yield顯著降低了20.8%(P<0.05)(圖4(b))。高光強培養的藻體，UVR誘導的Yield抑制率在各pH處理間無顯著差異(P>0.05)；而低光下培養的藻，pH值4.50下UVR誘導的抑制率在所有處理間最高，相較于pH值7.10處理升高了53.2%(P<0.05)(圖4(c))。

圖4 小球藻經正常pH值(7.10)以及模擬酸雨脅迫(pH值5.65和4.50)處理，轉移至高光(150 μmol·m-2·s-1)(a)和低光(60 μmol·m-2·s-1)(b)下培養24 h后，置于陽光模擬器下給予可見光(P)和可見光+紫外線A+紫外線B(PAB)輻射處理1 h的Yield和UVR誘導的抑制率(c) (n=3)Fig. 4 The Yield (a), (b) and its inhibition rate induced by UVR (c) of control pH (7.10) and acid stress (pH 5.65 and 4.50) treated Chlorella vulgaris that have been cultured under high (150 μmol·m-2·s-1) and low (60 μmol·m-2·s-1) light intensity for 24 h when exposure with P and PAB for 1 h (n=3)

對比高、低培養光強處理下UVR導致的抑制率，pH值4.50處理下，相對于高光培養的藻，UVR誘導的抑制率在低光強處理下增加了62.1%(P<0.05)；其余pH值處理下，高、低光強間無顯著差異(P>0.05)(圖4(c))。多因素方差分析表明，培養光強以及pH值處理都可顯著影響藻體對UVR的響應(抑制率)，且二者具有交互影響(P<0.05)。

總體上，pH值處理未對藻體rETRmax、α和IK產生影響(均P>0.05，three-Way ANOVA)；而紫外輻射顯著影響了藻體的rETRmax、α和IK(均P<0.05，three-Way ANOVA)(圖5和表2)。相較于P處理，PAB處理下rETRmax、α顯著降低，IK呈升高趨勢；培養光強與紫外輻射耦合顯著影響了α(P<0.05)和IK(P<0.05)(表2)。高光培養下的藻體經PAB輻射處理后，rETRmax、α隨pH值降低呈降低趨勢；低光培養下的藻體，經PAB輻射處理后，rETRmax、α和IK在各pH值間無顯著差異(P>0.05)，然而UVR誘導的rETRmax和α的抑制率在低光處理下整體高于高光培養的藻體(表2)。

圖5 小球藻在正常pH值(7.10)以及模擬酸雨脅迫(pH值5.65和4.50)處理后轉移至高光(150 μmol·m-2·s-1)(a)和低光(60 μmol·m-2·s-1)(b)下培養24 h后，置于陽光模擬器下給予可見光(P)和可見光+紫外線A+紫外線B(PAB)輻射處理1 h的快速光響應曲線(n=3)Fig. 5 The rapid light curve of control pH (7.10) and acid stress (pH 5.65 and 4.50) treated Chlorella vulgaris that have been cultured under high (150 μmol·m-2·s-1) (a) and low (60 μmol·m-2·s-1) (b) light intensity for 24 h, exposure with P and PAB for 1 h (n=3)

表2 根據圖5快速光響應曲線計算得到的不同光強水平、pH值下培養的小球藻經可見光(P)和可見光+紫外線A+紫外線B(PAB)輻射處理1 h的最大相對電子傳遞速率(rETRmax)、光能利用效率(α)和飽和光強(IK)(n=3)Table 2 The calculated maximum relative electron transport rate (rETRmax), light using efficiency (α) and saturation light intensity (IK) of Chlorella vulgaris that acclimated under high and low light intensity with different pH treatments, when exposure with P and PAB for 1 h, the calculation was according to figure 5 (n=3)

3 討論(Discussion)

對浮游植物光合生理過程以及群落結構組成產生調節效應的諸多生態因子中，水體pH值和光照(光質、光強)是最為主要的調節因子。小球藻是綠藻門中分布較為廣泛(淡、咸水水體)的世界性普生種類[18]，適應與耐受環境脅迫能力較強，也是新安江流域的重要優勢種類[9]，探討流域重要環境脅迫(酸雨與UVR)對其光合生理的影響，具有重要生態學意義。本研究結果表明小球藻對模擬酸雨引起的短期pH值降低有一定耐受能力，生長及色素對pH值降低的響應相較于培養光強影響的響應要低，低光、較低pH值(4.50)下培養的藻體光合過程對高光強、紫外輻射的敏感性增加。

酸雨的生態學效應在陸生植物中已開展了較多的研究[19-20]，酸雨引起的水體酸化對水生藻類的影響也有了一定的認識[21-23]。以往的研究表明，酸雨脅迫引起的水體短期或長期酸化可改變浮游[6, 24]或底棲生物群落結構組成[21]。酸雨引起的水體酸化其效應主要包括水體酸堿緩沖能力降低(pH值下降)和無機碳濃度、形式改變[25]，因不同門類、屬種的浮游植物的敏感程度(無機碳親和力、酸堿耐受能力)不同[26]，響應水體酸化的光合生理過程也存在顯著的種間或株系間差異[6-7]。本研究短期模擬酸雨臨界點pH值(5.65)對小球藻生長、細胞粒徑大小及色素含量均未產生顯著影響，相較于藍藻門銅綠微囊藻產毒株系905以及不產毒株系469[7]，小球藻對模擬酸雨引起的水體酸化耐受性較高、敏感性較低。這種響應模擬酸雨脅迫引起水體pH降低的種間差異性表現，在酸雨控制區內可能成為水體浮游植物群落結構組成的主要調節因素。浮游植物光合色素含量可受光強變動的調節[27-28]，本研究也表明光合色素(Chla、Chlb)受培養光強的影響較大、響應較快，而光合及光保護色素(類胡蘿卜素、MAAs)對短期pH值變化的響應不敏感，整體上未受光強或pH值影響。光保護色素未受培養光強升高的影響，表明本研究設置的高光培養(150 μmol·m-2·s-1)尚未達到其飽和光強，無需通過光保護色素的合成應對光脅迫。

水體酸化引起的H+濃度升高，酸堿耐受能力不同的藻類(胞內酸堿平衡調控)，其能量代謝過程(光合放氧、固碳、光呼吸及暗呼吸等過程)也將受到不同程度的影響，進而引起差異性的光合特性與生長表現[29]。水體H+增加(CO2濃度升高引起)與高光強耦合可顯著抑制浮游植物的光合效率、誘導高的非光化學淬滅(NPQ)從而抑制藻類生長[30-31]。本研究中也發現低pH/高H+與高的培養光強耦合，對藻體光化學效率產生協同抑制效應，表明較低的pH下藻體對光強的敏感性增加、光能利用效率降低。

以往研究表明UVR可通過損傷光系統光合元件(例如，光系統II關鍵蛋白D1、PsbA和PsbD等)[32-34]、誘導活性氧自由基等[35]降低藻體光合活性。此外，UVR與酸雨脅迫耦合可進一步降低浮游植物的光合能力，且這一影響存在種間/株系間差異[7]。本研究中UVR對Yield、最大相對電子傳遞速率(rETRmax)和光能利用效率(α)的抑制率在低pH值(4.50)、低光培養下的藻體中更為顯著，藻體對高光及紫外輻射的敏感性增加，這可能與低光培養下藻體相對較低的carotenoid/Chla以及光系統Ⅱ高的損傷、低的修復速率有關[34]。這一結果表明藻細胞經歷的光環境(高、低光強)可顯著影響水體酸化與UVR的耦合效應。

根據《中國生態環境狀況公報》公布的近30年的觀測數據，我國受酸雨影響的城市依然處于較高的比例(例如，2020年度發生酸雨的城市占所有監測城市的34.0%)，酸雨脅迫及其生態學效應在未來很長一段時間仍將是我國面臨的重要環境問題之一。淡水水體，尤其是河流生態系統，水體光環境(光強、光質)受水深、流速、濁度以及降雨量等因素影響，并存在季節變化特征。酸雨控制區不同門類、屬種的浮游植物如何響應與適應pH值與光環境的變化將對河流浮游植物的群落結構組成與變動起到重要調節作用。小球藻作為新安江流域主要優勢種類，對短期水體酸化有一定耐受能力，然而，氣候變化背景下其光合生理過程如何響應與適應未來長期、多重環境脅迫的影響，將決定其在水生態系統中的競爭優勢與結果。本研究是基于短期模擬酸雨脅迫與UVR耦合效應的研究，未來的研究將通過開展長期脅迫下的響應與適應機制探討，以及通過對流域其他門類(藍藻門、硅藻門等)、類群(例如非優勢種類)進行比較生理學分析，以系統了解酸雨控制區光強、光質如何影響水體浮游植物群落多樣性及演替規律。