網絡藥理學視角下瀉心湯對胃潰瘍的作用機制

吳 旭，徐 明，潘 洋

胃潰瘍（gastric ulcer，GU）是胃粘膜層和粘膜下層因胃腸防御因素與進攻因素的生物學狀態失衡從而發生病理學改變［1］，以上腹部周期性、節律性疼痛，伴有反酸、噯氣、上腹部有局限性壓痛為主要臨床表現的消化系統疾?。?］。西醫常選用質子泵抑制劑、胃酸中和劑、胃粘膜保護劑、抗生素等治療胃潰瘍，患者長期使用會有諸多不良反應，且病情容易反復［3］。中醫雖沒有胃潰瘍這一病癥，但從臨床表現來看可將其歸屬于“胃痛”“胃癰”等范疇，在整體思想和辨證論治的引導下運用中醫療法，療效可觀，并能大大提高患者的生活質量。

清熱瀉火之法是中醫藥治療胃潰瘍的主要方法之一，經典名方——瀉心湯具有苦寒直折、清瀉胃火之功。瀉心湯出于《金匱要略》，又名三黃瀉心湯，由黃連、黃芩、大黃3 味中藥構成。黃連味苦性寒，歸心、肝、膽、脾、胃經，功能為清熱燥濕、瀉火解毒；黃芩味苦性寒，歸肺、膽、脾、大腸，功能為清熱燥濕、瀉火解毒，止血；大黃，味苦性寒，歸脾、胃、大腸、心包經，功能為瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒。三藥合用，苦寒直折，清瀉火熱之邪。瀉心湯在中醫臨床中應用頗為廣泛，現代研究認為其具有抗炎、抑菌、抗幽門螺桿菌、保護胃粘膜、抑制腫瘤生長等多種藥理學作用［4-8］，可用于治療消化性潰瘍、幽門螺桿菌相關性胃炎、胃癌等多種消化系統疾病。有學者用瀉心湯結合溫針灸治療胃潰瘍患者30 例，臨床總有效率為93.33%［9］。有學者用瀉心湯結合針刺治療消化性潰瘍患者53 例，結果顯示，患者臨床癥狀顯著改善，血清中IL-6、TNF-α 和TGF-β1 較治療前明顯降低［10］。有學者將102 例幽門螺桿菌陽性慢性胃炎隨機分成治療組和觀察組，每組各51 例，治療組予瀉心湯和抗生素，觀察組予抗生素，結果顯示，治療組總有效率明顯高于對照組［11］。有學者在體外試驗中發現，瀉心湯可以顯著抑制胃癌細胞的增殖［8］。

從中醫學角度分析，胃潰瘍的發病可認為是濕熱之邪壅聚于胃，久而不去，蘊而化熱，熱盛肉腐，釀發癰瘍而成，且需清熱燥濕、瀉火解毒而治之。本文通過網絡藥理學的方法，以“成分-靶點-通路”相互作用關系為引導思路，從多層次、多方向、多角度對瀉心湯治療胃潰瘍的作用機制進行分析，希望通過“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網絡使中醫藥治療胃潰瘍的作用機制得以具體化、精準化、可視化，為進一步探討瀉心湯治療胃潰瘍作用機理奠定基礎。

1 研究過程與方法

1.1 瀉心湯有效成分的篩選

瀉心湯的組成為黃連、黃芩、大黃。在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中檢索3 味中藥的化學成分?？诜锢枚龋╫ral bioavailability，OB）是指口服藥物后，入血且可被機體吸收及利用的藥量與給藥量的比率；類藥性（drug-likeness，DL）是指化合物與已知藥物的相似性。當二者值越大時，則代表化合物對人體越有科學研究價值。本文參照了以往網絡藥理學研究準則，將OB≥30%、DL≥0.18 作為有效成分的納入標準。

1.2 有效成分作用靶點的篩選

在TCMSP 平臺上查找有效成分的作用靶點，利用UniProt數據庫查詢靶點所對應的人類基因組名稱。

1.3 胃潰瘍靶點基因的收集

以“gastric ulcer”為關鍵詞在GeneCards 數據庫中進行檢索，獲取胃潰瘍的相關靶點基因。

1.4 瀉心湯與胃潰瘍共同靶點基因的獲取

在在線韋恩圖平臺中輸入上文獲得的有效成分靶點基因和胃潰瘍靶點基因，以獲取瀉心湯與胃潰瘍的共同靶點基因，并繪制韋恩圖。使用Cytoscape 3.7.1 軟件繪制“中藥-有效成分-交集靶點基因”網絡圖。

1.5 構建蛋白質相互作用（PPI）網絡

在String 平臺中上傳上文獲得的“瀉心湯與胃潰瘍共同靶點基因”，物種設置選擇“Homo sapiens”，其他參數項為默認值，分析蛋白質的相互作用，構建蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，下載 TSV 文件。使用Cytoscape 3.7.1 對PPI 網絡進行可視化分析，取度中心性（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、緊密度中心性（closeness centrality，CC）的上四分位數，篩選出瀉心湯治療胃潰瘍的關鍵靶點基因。

1.6 GO 功能、KEGG 通路富集分析

在Metascape 數據庫中輸入上文獲得的“瀉心湯與胃潰瘍共同靶點基因”，在“物種設置”項選擇“H.sapiens”，設定P＜0.01 后，進行生物學過程（gene ontology）和代謝通路（KEGG pathway analysis）富集分析，利用在線網絡作圖工具Bioinformatics 繪制富集圖。

1.7 構建“中藥-有效成分-關鍵靶點-通路”網絡

將藥物及其有效成分、關鍵靶點基因、KEGG 富集通路（Count 值排名前20）導入Cytoscape 3.7.1 軟件中，構建“中藥-有效成分-關鍵靶點-通路”網絡。

2 結果與分析

2.1 瀉心湯有效成分及作用靶點篩選結果

以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，在TCMSP 數據庫中查詢到瀉心湯有效成分共63 個，其中黃連14 個，黃芩36個，大黃16 個（黃連與黃芩有2 個相同有效成分，大黃與黃芩有1 個相同有效成分），部分有效成分信息見表1。

表1 瀉心湯有效成分基本信息（部分）

續表1

將瀉心湯的63個有效成分導入TCMSP數據庫中進行檢索，獲得900 個作用靶點，其中黃連285個，黃芩506 個，大黃109 個。在Uniprot 數據庫中查詢靶點對應的人類基因名稱，然后進行基因名標準化處理。

2.2 胃潰瘍與瀉心湯共同靶點基因的獲取結果

以“gastric ulcer”為關鍵詞在GeneCards 數據庫中查詢到胃潰瘍相關靶點基因5 066 個，以得分≥5 為篩選條件進行篩選后得到960 個。瀉心湯的靶點基因去重后有228 個。在在線韋恩圖平臺上輸入胃潰瘍的重要靶點基因（得分≥5）和瀉心湯的去重靶點基因后得到109 個交集靶點基因，見圖1。將中藥、與交集靶點有直接作用關系的有效成分、交集靶點基因導入Cytoscape 3.7.1 軟件中制作“中藥-有效成分-交集靶點基因”網絡圖，見圖2。

圖1 瀉心湯與胃潰瘍交集靶點基因韋恩圖

圖2 “中藥-有效成分-交集靶點基因”網絡

圖2 所示的網絡中共有155 個節點、400 條連線，圓形表示中藥，六邊形表示有效成分（A1、A2 為黃連和黃芩共有成分，B 為大黃和黃芩共有成分），菱形表示交集靶點基因。其中節點越大，連線越密，則說明重要性越高，有效成分中HL10（槲皮素）、HQ2（漢黃芩素）、HQ4（黃芩素）、HQ1（刺槐素）、DH13（蘆薈大黃素）的節點較大，連線較密，分別對應度值為96、29、19、14、14。

2.3 瀉心湯治療胃潰瘍的蛋白質相互作用（PPI）結果

將上文獲得的109 個交集靶點基因上傳至String 平臺進行蛋白相互作用分析，創建PPI 網絡，見圖3，下載TSV 文件。在Cytoscape 3.7.1 軟件中對PPI 網絡進行可視化，取度中心性（DC）、介度中心性（BC）、緊密度中心性（CC）的上四分位數，篩選出瀉心湯治療胃潰瘍的關鍵靶點基因，見圖4。

圖3 瀉心湯治療胃潰瘍的PPI 網絡

圖4 瀉心湯治療胃潰瘍關鍵靶點的PPI 網絡

圖4 所示的網絡中包含25 個節點和598 條連線，故這25 個節點可能是瀉心湯治療胃潰瘍的關鍵靶點基因。其中節點越大，顏色越深，連線越密越粗，則說明地位越重要。AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA 的節點較大，顏色較深，連線較密較粗，度值分別為94、94、88、87、87，所以瀉心湯治療胃潰瘍的關鍵靶點基因可能為AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA。

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集結果

將瀉心湯和胃潰瘍的交集靶點基因上傳至Metascape 數據庫中進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，設置P＜0.01，獲得1 803 個GO 條目，其中生物過程（biological processes，BP）1 598 個，主要包括對無機物的應答、細胞凋亡的正調控、對激素的應答、細胞增殖的負調控、細胞粘附的調控；細胞組成（cellular components，CC）64 個，主要包括膜筏、膜微區、轉錄調控復合物；分子功能（molecular functions，MF）141 個，主要包括激酶結合、蛋白激酶結合、蛋白質同源二聚體化活性，相關條目見圖5；KEGG 富集通路176 條，主要包括癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路。取Count 值排名前20 的KEGG 富集通路，將其導入Bioinformatics 網站中制作高級氣泡圖，見圖6。

圖5 瀉心湯治療胃潰瘍的GO 功能富集圖

圖6 瀉心湯治療胃潰瘍的KEGG 富集通路氣泡圖

2.5 “中藥-有效成分-關鍵靶點-通路”網絡圖

將黃連、黃芩、大黃、與關鍵靶點有直接作用關系的有效成分、上文獲得的25 個關鍵靶點基因、Count 值排名前 20 的 KEGG 富集通路導入Cytoscape 3.7.1 軟件中制作“中藥-有效成分-關鍵靶點-通路”網絡圖，見圖7。

圖7 “中藥-有效成分-關鍵靶點-通路”網絡

圖7 所示的網絡中，圓形表示中藥，六邊形表示有效成分（A1、A2 為黃連和黃芩共有成分，B為大黃和黃芩共有成分），菱形表示交集靶點基因，V 形表示通路。該網絡可反映出瀉心湯通過“多成分、多靶點、多通路”的調控特點對胃潰瘍發揮治療作用。

3 結論與討論

通過TCMSP 數據庫、“中藥-有效成分-交集靶點”網絡圖得出，瀉心湯治療胃潰瘍的重要有效成分為槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、刺槐素、蘆薈大黃素。槲皮素具有抗炎、抗氧化、抑制胃酸分泌等多重藥理學功能，還可以通過抑制機體IL-6、TNF-α、VEGF 等炎癥因子的產生而發揮其抗炎作用［12］。胃潰瘍發生后胃粘膜表現出炎癥應激反應［13-15］，所以槲皮素可以通過其抗炎作用減輕胃粘膜的炎癥應激反應。槲皮素對胃酸的排泌也能產生良好的抑制作用［16-17］，所以槲皮素也能夠利用其抑酸的功能減少胃酸對潰瘍面的破壞從而促使消化道黏膜的修復。幽門螺桿菌感染是胃潰瘍發生的重要原因之一［18］，槲皮素還可以抑制幽門螺桿菌在機體中的生長［17,19-20］。漢黃芩素、黃芩素也具有較好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多重藥理學功能，能夠抑制機體TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、COX-2 等多種炎癥因子的產生而發揮抗炎作用［21-24］。漢黃芩素可以下調JAK1/2 的表達減少STAT3 的磷酸化進而加快胃癌細胞的凋亡［25］。有試驗研究結果表明黃芩素能夠上調胃癌MGC-803 細胞中caspase-3、PARP 水平，下調PARP 水平進而促進胃癌細胞的凋亡［26］。所以漢黃芩素、黃芩素能夠抑制機體炎癥因子的生成，降低胃粘膜炎癥反應，從而對胃潰瘍產生治療效應。此外，胃潰瘍為胃癌前狀態，漢黃芩素、黃芩素又能促進胃癌細胞的凋亡，可以預防胃潰瘍進一步朝向胃癌發展，所以瀉心湯治療胃潰瘍能體現出中醫學“治未病”的理論思想。刺槐素使Fas 和FasL、Bax 和p53 的表達上調，Bcl-2和Bad 的表達下調，通過活化Fas 通路抑制了胃癌AGS 細胞的增殖并誘導其凋亡［27］。刺槐素還具有良好的鎮痛作用。有研究報道，在小鼠的扭體試驗中發現ED50的刺槐素鎮痛作用明顯強于ED50雙氯芬酸鈉［28］，所以瀉心湯治療胃潰瘍時除了有抗炎、抗腫瘤的效果外，還具有對癥止痛的作用。胃粘膜被胃酸、胃蛋白酶自身破壞是胃潰瘍發病的主要原因［29-31］，蘆薈大黃素可以抑制胃酸的分泌［32-33］，與胃蛋白酶結合形成復合物后改變其構象［34-35］，減少胃酸、胃蛋白酶對胃粘膜的侵蝕。

由蛋白相互作用（PPI）結果、瀉心湯治療胃潰瘍關鍵靶點的PPI 網絡可知，瀉心湯治療胃潰瘍核心靶點為AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA。AKT1 是AKT 家族中的一個亞型，是參與機體炎癥反應的靶點基因［36-37］。AKT1 可以通過促進CD4+T細胞向Th17 細胞的轉化，進而調控促炎癥因子IL-17 的表達［38］。有試驗研究報道，AKT1 表達上調后可以促進巨噬細胞向M2 型極化，減輕機體組織的炎癥反應［39］，所以可以通過瀉心湯來調控AKT1 降低促炎癥因子的產生，減輕胃粘膜的炎癥應激反應，達到治療胃潰瘍的目的。正常的TP53可以促進機體胃粘膜及組織的修復，但突變后基因異常表達，其原有的抑癌功能缺失，誘導胃粘膜細胞凋亡，增加胃潰瘍向胃癌發展的風險［40］。有相關文獻報道，胃潰瘍模型大鼠TP53 有明顯的升高，胃粘膜的損傷程度與TP53 突變型基因的表達呈正相關［41］。瀉心湯可能是通過下調TP53 突變型基因的表達，減輕胃粘膜的損傷，促進胃粘膜的修復而對胃潰瘍起到治療作用。IL6、TNF 均為炎癥因子編碼基因。有相關研究報道，胃潰瘍患者相較于健康人，血清中TNF-α、IL-6 水平明顯偏高［42-43］。TNF-α 可促進急性蛋白的生成，活化中性粒細胞，炎癥組織內血小板凝聚，血氧降低，對胃粘膜造成持續性傷害［44］。因此可以推測，使用瀉心湯可以下調IL6、TNF 基因的表達，減少炎癥因子的產生，減輕炎癥對胃粘膜組織的損傷。VEGFA 是血管內皮生長因子A 的編碼基因，表達上調后可以活化血管內皮細胞，誘導新的血管形成［45］，還可以抑制TNF、IL6 的生成，從而降低機體炎癥反應［46］。

通過GO 功能富集分析可知，生物過程富集程度較高的是對無機物的應答、細胞凋亡的正調控、對激素的應答、細胞增殖的負調控、細胞粘附的調控；細胞組成富集程度較高的是膜筏、膜微區、轉錄調控復合物；分子功能富集程度較高的是激酶結合、蛋白激酶結合、蛋白質同源二聚體化活性。通過KEGG 通路富集分析得出，富集程度較高的通路為癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路。PI3K-Akt 信號通路激活后可以調控胃粘膜上皮細胞的生長、增殖［47］。有研究證實MAPK 信號通路與胃潰瘍的發生密切相關，該通路的EGFR/ERK 信號轉導通路中的任何一個分子表達異常都將會導致胃潰瘍的發生［48］。

綜上所述，本文基于網絡藥理學的研究方法，對瀉心湯的多成分、多靶點與胃潰瘍之間的網狀關系進行了研究，認為瀉心湯通過槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、刺槐素、蘆薈大黃素等有效成分調控AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA 等核心靶點，以及癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路等主要通路，發揮抗炎、抑酸、抗幽門螺桿菌、保護胃粘膜、防癌抑癌等作用，對胃潰瘍起到治療目的。

4 結語

網絡藥理學屬于生物信息學的分支，可以利用公共數據庫平臺、計算機軟件和數據分析技術尋找醫學生物信息，構建并分析藥物與疾病之間的網絡關系。本文以經典名方——瀉心湯與疾病胃潰瘍作為研究對象，應用網絡藥理學的方法，使用相關數據庫及軟件篩選并分析瀉心湯治療胃潰瘍所涉及的有效成分、靶點、通路，通過GO 功能富集分析，構建“有效成分-交集靶點-通路”網絡，將它們之間的相互作用關系進行可視化，找出瀉心湯治療胃潰瘍的核心成分、核心靶點、主要通路，為進一步研究瀉心湯治療胃潰瘍作用機制提供了參考。