大豆轉錄因子GmWIN1-1的鑒定與表達分析

蔡桂萍，黃旭升，史先飛，李潤植，張 莉

（山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801）

大豆（Glycine max）是世界主要的糧油作物之一，為人類提供豐富的蛋白質和食用油，亦是畜禽飼料的優質資源[1-2]。但在我國大豆種植面積小，并且在整個生長發育過程中經常受到各種逆境因素的影響，目前大豆油的主要來源仍然依靠進口[3]，提高大豆產量成為了一項艱巨的任務[4]。因此，挖掘大豆抗逆基因和解析其作用的分子機制具有重要意義，可為培育高產優質和多重抗逆性的優良大豆品種奠定基礎。

已有研究表明，基因的啟動子是一段能被RNA聚合酶識別與結合，并啟動基因表達的DNA序列。啟動子含有多種順式作用元件，可調控非生物脅迫、光照、植物激素等信號通路。例如，彭亞男[5]在大豆中發現，GmCBL7基因啟動子參與調控大豆對高鹽和干旱脅迫的應答。馮志娟等[6]研究發現，大豆GmTIP2：6基因啟動子促使低溫、高鹽脅迫下GUS酶活性上調表達。因此，啟動子核心順式元件的鑒定有助于研究靶基因介導植物抗逆性機制。

轉錄因子作為一種DNA結合蛋白，可與啟動子順式作用元件相互作用，激活或抑制目標基因轉錄。轉錄因子WAX INDUCER1/SHINE1（WIN1/SHN 1）是AP2/ERF（APETALA 2/ethyleneresponse factor）超家族的ERF-B6亞家族[7]，已發現在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[8]、水 稻（Oryza sativa）[9]、小麥（Triticumaestivum）[10]、大麥（Hordeumvulgare）[11]、番 茄（Lycopersiconesculentum）[12]、蘋 果（Malus pumila）[13]和甘藍型油菜（Brassica napus）[14]等高等植物中介導蠟質生物合成調控。其中，在擬南芥中過表達AtWIN 1導致葉和莖表皮蠟質積累以及擬南芥耐旱性的顯著增加[15]。在鹽脅迫條件下，過表達BnWIN 1導致甘藍型油菜蠟積累增加了20%~22%，并促進了生長，而油脂積累未有明顯變化[14]。在硬粒小麥中Td SHN1的過表達增加了酵母對多種非生物脅迫的耐受性[10]。目前，還未發現關于大豆WIN1家族成員介導大豆油脂生物合成和脅迫應答及其他生物學過程的調控。

為深入了解轉錄因子GmWIN1-1是否介導大豆油脂合成和非生物脅迫響應的調控，本研究依據已有的大豆轉錄組數據，以擬南芥AtWIN1蛋白序列為索引，同源比對鑒定獲得1個具有完整開放閱讀框（ORF）的大豆GmWIN1-1；使用生物信息學軟件分析其編碼蛋白理化性質、蛋白結構和基因啟動子順式元件等，并采用qRT-PCR分析轉錄因子GmWIN 1-1在大豆不同組織中的表達量以及對干旱脅迫的響應，為深入研究大豆GmWIN1家族成員生物學功能和大豆抗逆性遺傳改良提供新見解。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以生長周期較短的大豆優選品種Jack為試驗材料。

1.2 材料處理

選取長出第1片真葉的大豆幼苗，用質量分數為20%的PEG6000溶液進行干旱脅迫處理[16]，共設置7個處理時間，即0、2、4、6、9、12、24 h，每個處理時間取材3株。

1.3 Gm WIN1-1蛋白的生物信息學分析

以擬南芥AtWIN1編碼序列為索引，在山西農業大學分子農業與生物能源研究所實驗室已有的大豆轉錄組數據庫中Blast比對，獲得轉錄因子GmWIN1的cDNA序列信息。使用NCBI-ORF分析cDNA序列是否具有完整的開放閱讀框（ORF），經比對分析獲得1條具有完整開放閱讀框的大豆GmWIN1 cDNA序列，命名為GmWIN 1-1。通過NCBI中CDD數據庫分析GmWIN1-1的保守結構域。利用Gene Structure Disply Server網站分析GmWIN1-1的基因結構[17]。

利用在線網站ProtParam分析大豆GmWIN1-1蛋白理化性質；利用Ex PASy數據庫中的ProtScale預測疏水性；利用在線網站SOPMA預測GmWIN1-1蛋白二級結構構成；在線網站SWISSMODEL對GmWIN1-1蛋白進行三級結構預測分析并建模[18]；在線軟件PlantCARE預測GmWIN1-1起始密碼子前2 000 bp序列的核心作用元件。所有生物信息學工具網址如表1所示。

表1 生物信息學工具Tab.1 Bioinformatics tools

1.4 GmWIN1-1蛋白的多序列比對和系統發育分析

從NCBI中調取水稻、紫花苜蓿、大麥、擬南芥的WIN 1蛋白序列，使用DNAMAN軟件比對不同物種WIN1蛋白序列相似性。使用在線軟件MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析不同物種WIN 1蛋白序列的基序。運用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining）對GmWIN1-1蛋白構建系統進化樹，設定Bootstrap值為1 000[19]。

1.5 RNA提取及實時熒光定量PCR

用植物Transzoltm試劑（Transgen Biotech，北京）提取了大豆的總RNA，用gDNA remover（GenStar，中國）去除基因組DNA污染。用StarScriptⅡRT Mix（GenStar，中國）將第一鏈互補DNA（cDNA）在20μL體積的總RNA（2μg）合成。

以上述的cDNA為模板，擴增引物序列如表2所示。依照TB Green?Premix Ex Taq?II（北京TaKaRa）說明方法進行qRT-PCR檢測，設置6個生物重復。

表2 熒光定量PCR所用引物Tab.2 Primers used in fluorescence quantitative PCR

1.6 數據處理

采用Bio-Rad CFX Manager和IBM SPSS Statistics 20軟件對數據進行統計分析。采用單因素（One-way ANOVA）和Duncan法進行方差分析和多重比較（α=0.05）。利用Excel 2003和Adobe Illustrator CS6軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 大豆Gm WIN1-1轉錄因子的鑒定

依據模式植物擬南芥AtWIN1的編碼序列，在山西農業大學分子農業與生物能源研究所實驗室已有的大豆轉錄組數據Blast比對，獲得幾個候選GmWIN1成員。經比對分析獲得1條具有完整開放閱讀框（ORF）的候選GmWIN 1，命名為GmWIN1-1。該cDNA閱讀框全長570 bp，編碼189個氨基酸（圖1）。結構域預測結果如圖2所示，AtWIN 1和GmWIN1-1分別具有1個AP2保守結構域?；蚪Y構結果如圖3所示，AtWIN 1和GmWIN1-1均含2個外顯子和1個內含子，且具有5′和3′非翻譯區。

2.2 大豆Gm WIN1-1蛋白的基本理化性質分析

利用ProtParam工具分析大豆GmWIN1-1蛋白基本理化性質，結果如表3所示。該蛋白長度為189個氨基酸；理論等電點為8.45，屬于堿性蛋白；蛋白的分子質量為21.2 ku；該蛋白的不穩定性指數為68.34，屬于不穩定蛋白；脂肪系數為69.63；總平均親水系數為-0.694，為親水性蛋白。疏水性結果如圖4所示，在0以下的峰居多，與基本理化性質預測結果一致，屬于親水性蛋白。

表3 GmWIN1-1蛋白理化性質Tab.3 Physical and chemical properties of GmWIN1-1 protein

2.3 大豆Gm WIN1-1蛋白的高級結構分析

利用在線軟件SOPMA預測GmWIN1-1蛋白的二級結構，結果如圖5所示，無規則卷曲所占的比例最高，為50.79%，α-螺旋所占的比例為30.69%，延伸鏈和β-轉角所占的比例分別為13.23%和5.29%。分析結果表明，大豆GmWIN1-1蛋白的二級結構主要由α-螺旋和無規卷曲構成，該蛋白為混合型蛋白。

用SWISS-MODEL軟件分析GmWIN 1-1蛋白的三級結構，結果如圖6所示，使用模板蛋白5wx9.1對GmWIN1-1蛋白進行同源建模，模板蛋白與GmWIN1-1蛋白氨基酸序列相似性為45%，覆蓋率為34%，GmWIN 1-1的保守序列范圍為4-68位氨基酸。

2.4 大豆GmWIN1-1蛋白的序列比對及系統進化分析

通過DNAMAN軟件對GmWIN1-1、AtWIN 1、OsSHN1、MtWIN1、HvWIN1蛋白進行氨基酸序列比對，結果如圖7所示，GmWIN1-1與其他物種WIN 1蛋白序列長度為189~213個氨基酸，GmWIN1-1與AtWIN1的相似度最高（63.32%）?；蚍治鼋Y果如圖8所示，在N端有一段AP2保守基序（AP2 Domain），此外，還發現中間基序（Middle motif，mm）和C端基序（C-terminus motif，cm）。

通過MEGA 7.0軟件對GmWIN1-1和其他植物WIN 1蛋白進行多序列系統進化分析，結果如圖9所示，HvWIN1與OsSHN1具有較高的親緣關系，其次是GmWIN1-1與MtWIN1具有較高的親緣關系，這些成對的蛋白可能具有共同的祖先和相似的生物學功能。

2.5 大豆GmWIN1-1啟動子順式元件分析

通過在線軟件PlantCARE預測GmWIN1-1起始密碼子前2 000 bp序列的順式作用元件，結果如表4所示，GmWIN 1-1啟動子中含有4個脫落酸元件、6個厭氧誘導元件、2個干旱響應元件、4個光反應元件、1個赤霉素反應元件、1個myb結合位點，推測GmWIN1-1可能受干旱脅迫的調控。

表4 GmWIN1-1啟動子核心元件預測Tab.4 Prediction of GmWIN1-1 promoter core elements

2.6 大豆Gm WIN1-1在不同組織中的表達模式分析

選取大豆不同器官和不同時期的種子為試驗材料，檢測轉錄因子GmWIN 1-1的表達譜。qRTPCR結果如圖10所示，GmWIN1-1表達量最高的器官是花，分別是莖和根中表達量的1.7倍和5倍，而在其他組織中的表達量極低。

2.7 干旱脅迫下大豆幼苗表型和GmWIN1-1表達模式分析

根據啟動子核心作用元件預測，推測GmWIN1-1可能受干旱脅迫誘導。由圖11-A可知，干旱脅迫處理導致大豆幼苗發生嚴重萎蔫。qRT-PCR檢測結果表明（圖11-B），與未處理對照株相比，GmWIN1-1的表達量有明顯的變化，表現為小幅度先下降再上升又下降的趨勢，在6 h達到最高值。這些結果顯示，GmWIN1-1可能參與大豆幼苗干旱脅迫應答。

3 結論與討論

分析大豆脂質合成、代謝和逆境調控機制將為提高大豆產量提供新的理論依據。鑒于油脂生物合成、代謝和逆境調控網絡的復雜性質，已有研究發現，WRI1、WRKY和MYB等轉錄因子通過同時調節眾多基因發揮重要作用[20-22]。本試驗所研究的轉錄因子WIN1是蠟生物合成過程中的關鍵調節因子，近年來研究發現，該轉錄因子與甘藍型油菜中的油積累和鹽脅迫有關，但在大豆脂質積累和非生物脅迫響應中的作用尚不明確。

本研究通過Blast比對，獲得轉錄因子GmWIN 1-1，由189個氨基酸構成，是一個單體蛋白。蛋白高級結構分析發現，GmWIN1-1蛋白的二級結構中無規則卷曲所占比例最多，推測其可能連接其他二級結構元件；蛋白的三級結構與模板蛋白5wx9.1相似性為45%；多序列比對發現，大豆GmWIN 1-1與其他物種WIN1不僅在N端具有1個AP2功能結構域，還分別具有1個中間基序和C端基序；系統發育樹分析發現，GmWIN1-1與MtWIN 1的親緣關系較近，可能是由于它們屬于同一亞科（蝶形花亞科）。通過以上生物信息學分析，推測大豆GmWIN 1-1蛋白應具有與其他物種一樣的WIN1活性。

本研究發現，GmWIN 1-1在花中的表達量最高。類似地，在許多高等植物的花蕾中也檢測到WIN1具有高表達。已發現TAG占花粉質量的30%~40%，因此，推測TAG參與的有性生殖可能與WIN1有關，但是WIN1轉錄因子在花粉中的具體作用尚不清楚，仍需進一步試驗研究[23-24]。在本研究中發現，GmWIN1-1參與大豆幼苗的干旱脅迫響應。此前，已有研究發現，BnWIN1過表達增加了油菜種子的油含量，同時轉基因植物的鹽脅迫耐受性增強[13]。盡管AtWIN1過表達導致了擬南芥的生長遲緩和種子油變化，但它導致蠟質生物合成和耐旱性增強[15]，顯然，不同植物物種在各種生物過程中的功能存在差異?；驅Ψ巧锩{迫的響應可能是由啟動子本身引起，也可能與啟動子相互作用的轉錄因子有關[25-26]。已有研究表明，在擬南芥中MYB106調控WIN1基因表達，轉錄因子MYB家族主要參與植物逆境脅迫，這也可能是GmWIN1-1響應干旱脅迫的原因之一[22]。在大豆中轉錄因子MYB是否調控基因GmWIN 1-1有待進一步的試驗驗證。

本研究鑒定獲得1個大豆GmWIN1-1轉錄因子，通過生物信息學預測了GmWIN1-1蛋白理化性質及功能。GmWIN1-1在花中表達最高，其基因啟動子含有多個逆境響應順式元件。GmWIN1-1顯著響應干旱脅迫，可能介導大豆幼苗脅迫應答調控。