苗期冷凍法快速鑒定小偃麥衍生系的抗寒性

郭慧娟，常利芳，喬麟軼，2，李 欣，2，張樹偉，陳 芳，賈舉慶，暢志堅，2，張曉軍，2

（1.山西農業大學 農學院/作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西太原 030031；2.山西農業大學 省部共建有機旱作農業國家重點實驗室（籌），山西太原 030031）

小麥是(Triticum aestivumL.)是我國三大主要糧食作物之一，也是受低溫凍害威脅最嚴重的作物之一[1]。在華北地區，冬季氣溫較低，有些小麥品種因抗寒性差導致大量分蘗和主莖死亡，品種無法正常越冬，來年的公頃穗數大幅減少，直接影響產量。尤其是近年來隨著全球氣候變化，極端寒冷天氣頻現，寒冬和倒春寒等自然災害時有發生，嚴重影響了小麥安全生產。因此，對小麥品種進行抗寒性鑒定，挖掘與利用抗寒種質，培育抗寒品種，對于保證小麥的高產和穩產具有重要意義[2-3]。

快速準確鑒定品種的抗寒性是小麥抗寒育種及其種質改良的前提[4]。目前，北部冬麥區品種抗寒性鑒定完全依靠自然鑒定，受年度間冬季溫度變化的影響，鑒定結果年度間差異較大，品種抗寒性鑒定的可靠性受到影響，亟需增加在可控條件下的品種抗寒性鑒定試驗并建立相應的鑒定評價標準。而室內抗寒性鑒定主要通過形態學、細胞學、分子生物學及一些生理生化指標進行鑒定，其中，室內低溫處理、生理生化指標間接鑒定[5]及田間調查越冬死株死莖率、返青率是目前應用較多的鑒定方法[6]。劉艷陽等[7]通過超氧化物歧化酶和過氧化物酶的活性測定及低溫脅迫后細胞膜透性來測定小麥品種的抗寒性。姜麗娜等[8]通過測定小麥拔節期低溫脅迫下葉片的生理指標，發現葉片相對導電率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性可作為小麥拔節期抗寒性鑒定評價指標。辛艷等[9]在田間自然條件下，通過計算越冬前后枯株、死莖的百分率法評價品種的抗寒性，同時采用田間目測法評定材料的凍害等級。張淑霞等[10]通過室內梯度緩慢降溫冷凍法研究小麥品種的抗寒性，并提出了臨界溫度值的概念，使抗寒性鑒定更符合生產需求。但是，室內低溫處理后通過生理生化指標測定小麥抗寒性的技術過程繁瑣，測定誤差較大，準確性受到限制。而田間越冬返青率調查受環境影響較大，遇到暖冬則無法獲得品種抗寒性結果。因此，如何在室內可控條件下準確簡便鑒定小麥品種的抗寒性成為當下亟待解決的問題。

趙瑞玲等[11]通過室內梯度降溫的方法對幼苗進行一定時間的低溫冷凍處理后，通過測定不同溫度下植株電導率的變化及幼苗冷凍成活率來鑒定不同小麥品種抗寒性，可以得出較為可靠的鑒定結果，但其鑒定方法過于復雜，不適合大量材料的鑒定。為了探索一種室內快速、準確鑒定小麥苗期抗寒性的方法，本研究采用實驗室內低溫限時冷凍法，對利用小麥和偃麥草遠緣雜交獲得的29份小偃麥衍生種質進行了室內苗期冷凍成活率測定，結合田間越冬調查，分析與小麥田間越冬凍害等級的相關性，篩選抗寒性較好的小偃麥衍生系種質資源，以期為小麥抗寒育種及遺傳研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗選用29份小偃麥衍生系材料，以品種長6878作為抗寒性對照，SY 95-71為半冬性對照。以上31份材料均由山西省作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 室內苗期冷凍鑒定 苗期鑒定試驗于2020年10—12月在山西農業大學農學院小麥染色體工程實驗室進行。每份材料選大小均勻飽滿的籽粒50粒，用蒸餾水沖洗3次，5%的NaClO消毒15 min后，再用蒸餾水沖洗3~5次，種胚向上擺放于雙層濾紙作為基質的培養皿中。每個材料3個重復，加入10 mL的蒸餾水，置于22℃的人工氣候培養箱中培養10 d，每隔2 d加入適量的蒸餾水。幼苗生長至2葉1心時，調查每個處理的幼苗數量。

將生長有幼苗的培養皿放入冷藏室內，4℃條件下預冷凍處理24 h。然后放入-18℃冷柜中，處理3 h。冷凍結束后，在4℃條件下解凍24 h，再置于20℃條件下進行恢復培養，期間適時補充無菌水。7 d后調查存活苗數，以葉片轉呈鮮綠色者為存活。參考陳超等[5]的方法，計算冷凍成活率和抗寒系數。

1.2.2 田間越冬性調查 2020年9月底，將供試材料播種于山西省晉中市榆次區東陽試驗基地，采用隨機區組設計，2次重復。每個材料按小區進行播種，小區長2 m、寬0.5 m，小區面積1 m2，行距0.25 m，播種量為30粒/行。2021年3月小麥返青后，參照游光霞等[2]和武銀玉等[12]鑒定方法，鑒定材料的越冬凍害嚴重度。共分6級：1級，葉片無凍害；2級，葉尖受凍害發黃，葉片少量枯萎；3級，植株葉片多枯萎，但無凍死，基部仍有綠色；4級，地面有整片枯葉，近半數植株凍死；5級，葉片全部枯萎，多數植株凍死；6級全部植株全株凍死。

1.2.3 田間農藝性狀調查 2021年6月材料成熟后每個材料隨機選取10株測定產量相關農藝性狀，主要包括株高、分蘗數、穗長、每穗小穗數、穗粒數、千粒質量和總產量。千粒質量為籽粒收獲后測定3次，取平均值。穗長、每穗小穗數和穗粒數取每個單株的主穗進行測定，結果取平均值。小區產量為小麥成熟后，收獲該小區全部植株測定籽粒產量。

1.3 數據分析

冷凍成活率和抗寒系數利用Excel 2010軟件進行計算分析?？购禂蹬c產量性狀的相關分析采用IBM SPSS V 22.0進行計算。

2 結果與分析

2.1 供試材料冷凍成活率比較

經-18℃冷凍處理3 h后，供試材料的冷凍成活率變幅為0.67%~87.33%，平均值為32.20%，變異系數為92.36%。由表1可知，對照長6878的成活率最高，為87.33%，半冬性對照SY 95-71的成活率僅為16.21%。品系16W16-1、CH15132、CH7034、CH 1677的平均成活率均大于80%，具有較強的抗寒性；CH 1302、CH 1532、CH262和14W29的平均成活率均大于45%，為中度抗寒材料；其余材料成活率低于45%，抗寒性較差，其中，品系CH1357的平均成活率最低，僅為0.67%。

表1 供試材料抗寒系數與農藝性狀Tab.1 Cold resistance coefficient and agronomic traits of the tested materials

續表1 供試材料抗寒系數與農藝性狀Tab.1（Continued） Cold resistance coefficient and agr onomic tr aits of the tested materials

續表1 供試材料抗寒系數與農藝性狀Tab.1（Continued） Cold r esistance coefficient and agr onomic tr aits of the tested mater ials

根據公式計算每個品系的抗寒系數，其結果顯示16W16-1、CH15132、CH7034、CH1677抗寒系數均 大 于90%，抗 寒 性 良 好；CH 1302、CH 1532、CH 262均大于60%，有一定的抗寒性；而CH 1364、CH16104、CH1343、CH1361、13W43H、CH15145、CH 1355、CH 1357等10個品系的抗寒系數均小于10%，易受凍害影響。

2.2 供試材料田間越冬凍害程度

供試材料田間越冬凍害分布如圖1所示。

2021年小麥返青后調查發現，凍害等級最大為6級，最小為2級，變異系數為31.04%，每個等級材料份數分布見圖2。其中對照品種長6878凍害2級，半冬性對照SY 95-71凍害為5級。供試材料中16W16-1、CH 7034的凍害等級與長6878相當，CH1302、CH15132、CH1677、CH1532、CH262和16W23-3的凍害等級為3級，共有54.8%的供試材料凍害等級大于4級；CHL10、13W43H、CH15145、CH 1355、CH 1357、CH 1361、CH 1343和CH 1364等8個品系凍害等級最高，與室內冷凍法鑒定結果基本吻合。進一步的相關分析表明，田間凍害級別與室內冷凍成活率呈極顯著負相關（P<0.01），相關系數為-0.906?？梢?，采用室內冷凍成活率可以有效鑒定供試材料的抗寒性。

2.3 抗寒性與產量性狀的相關性分析

從各性狀的平均值來看（表1、2），31份測試品種（系）的平均株高為82.17 cm，以對照品種長6878（116.27 cm）最高，CH1343（52.40 cm）最矮；有效分蘗數平均為4.52個，以CH 1355（6.86個）最多，16W16-1（2.66個）最少；穗長平均為8.32 cm，CH 15145（11.77 cm）穗子最長，CH 15132（5.51 cm）最短；每穗小穗數平均為21.62個，CH15145（32.03個）最多，CH 1517（16.58個）最少；穗粒數平均為54.75粒，13W43H（84.73粒）最多，CH7034（31.49粒）最少；千粒質量平均為38.99 g，CH 15145（59.52 g）為最高，CH7034最低（25.76 g）；小區產量平均為166.79 g，CH 1677最高，為457.59 g，而CH1357最低，僅6.19 g?？梢?，這些品種（系）表型性狀差異較大，變異類型豐富多樣，有利于對其數據進行統計分析。

通過對小偃麥衍生系抗寒系數與7個產量相關性狀的方差分析（表2），可以看出，抗寒系數與有效分蘗數和小區產量均呈極顯著相關（P<0.01），表明品種（系）的抗寒性可以顯著影響植株的有效分蘗數和小區產量。從圖2可以看出，隨著抗寒系數的增加，即品種（系）抗寒性的增強，該品種（系）的小區產量呈顯著增加的趨勢，而有效分蘗數則呈顯著減少的趨勢?？购禂蹬c穗長、千粒質量、每穗小穗數和穗粒數均呈顯著相關（P<0.05），表明品種（系）的抗寒性也可以顯著影響植株的穗長、千粒質量、每穗小穗數和穗粒數。隨著抗寒系數的增加，穗長、千粒質量、每穗小穗數和穗粒數均呈減少的趨勢?？购禂蹬c株高的差異不顯著，表明抗寒性對株高的影響較小。

表2 抗寒系數與產量相關性狀的方差分析Tab.2 Variance analysis of cold resistance coefficient and yield related traits

3 結論與討論

小麥因具有較強的生態適應性而在全世界廣泛分布，其抗寒性強弱是影響品種廣適性的重要特征之一。低溫是限制小麥生長、發育的主要因素之一，在我國從南到北幾乎所有的小麥種植區都會受到寒害的威脅[13]。在小麥的不同生育時期，影響其生長發育和產量的主要有冬季凍害、早春凍害和低溫冷害[14-16]。不同生長時期的凍害對小麥影響不同，研究表明，拔節、孕穗期低溫嚴重影響小麥產量[17-18]。山西省地處內陸，氣候干旱，冬季易受極端低溫天氣影響，春季易出現倒春寒，抗寒材料的鑒定選育尤為重要[19]。

根據田間越冬率鑒定品種的凍害等級是抗寒性鑒定最直接的方法，但田間鑒定需要多年多點重復試驗，耗時長，工作量大，而且很容易受到環境的影響。小麥抗寒性的室內鑒定方法目前多采用冷凍處理后測定生理生化指標，鑒定效率和準確性有一定的限制[20]。冷凍成活率是室內鑒定小麥抗寒性最直觀的指標，也是植株抗寒性的直接體現。本研究采用-18℃冷凍3 h作為快速鑒定的條件，是在參考趙瑞玲等[11]研究的基礎上，以冷凍成活率來檢測植株受到極端低溫天氣后的恢復能力來衡量品種的抗寒性能。但是小麥材料的抗寒性受生態區影響，無法采用統一的衡量標準，這為室內鑒定的準確性帶來了一定的困難。本研究在此基礎上增加了本生態區抗寒品種作為對照，并將最終的鑒定結果以對照品種為參照轉換為抗寒系數，其結果能夠更加直觀準確地反映供試材料在所在生態區的田間抗寒能力。

優良抗旱種質資源的篩選評價是小麥抗旱性育種及遺傳的基礎。偃麥草屬（Thinopyrum）植物隸屬禾本科小麥族，是多年生草本植物，起源于東歐，天然分布于高加索、中亞等地帶。它根系發達，能夠深入土層深處，抗寒性極強，能夠抵抗-40℃低溫，對凍害、寒害具有天然的優勢，富含大量的抗寒基因，是小麥遺傳改良的優異基因庫[21-22]，也是小麥遺傳改良中應用最成功的物種之一。本研究鑒定的29份材料來源于普通小麥與八倍體小偃麥的雜交組合，其中八倍體親本TAI7045、TAI8505、TAI8335和XY 7430都表現出較強的抗寒性[23-25]，但其后代材料的抗寒性出現了較明顯的分離，參試的29份材料分別源于4個八倍體小偃麥的10個組合，其中源于XY 7430的有19份，源于TAI8505和TAI8335的分別有4份，源于TAI7045的有2份?？购禂荡笥?0%的4份材料中有3份來自XY 7430，1份來自TAI8505。29份材料中源于TAI7045的2份材料抗寒系數均低于20%，源于TAI8335的4份材料凍害等級均為4級以上，抗寒系數均低于50%。源于TAI8505的4份材料中有2份表現出較強的抗寒性，另2份抗寒性較弱。來源于XY 7430的19份材料中也有13份抗寒系數低于50%，這可能是由于材料選育過程中由于未進行抗寒性定位選擇而使抗寒基因丟失所致。因此，在品種選育與種質資源篩選時，應將品種的抗寒性作為一個重要的指標進行考察。

本研究通過室內冷凍法快速鑒定了29份小偃麥衍生種質的苗期成活率，篩選出4份抗寒系數大于90%的小偃麥衍生系，分別為16W16-1、CH15132、CH7034、CH 1677，經 過 田 間 越冬率 驗證，本研究采用的苗期冷凍成活率與田間凍害級別呈極顯著負相關，表明采用室內冷凍法可有效鑒定小麥品種的抗寒性，同時這些品種在小麥產量相關重要性狀上均表現優異，可為小麥抗寒育種及遺傳研究提供了新的優異種質資源，為挖掘新的抗寒基因奠定了基礎，對小麥抗寒育種和抗寒性遺傳研究具有重要意義。但在生產實踐中應注意，小麥能否安全越冬不僅取決于品種的抗寒性，也受其他因素如水肥管理措施、天氣寒冷程度等影響[26]，因此，對小麥抗寒性的評價需綜合考查。