p53凋亡刺激蛋白2基因肝臟條件性敲除小鼠的構建和鑒定*

寇卜心，柴夢音，豆雙雙，龐麗君，陳德喜，劉曉霓

條件性基因敲除(conditional knockout，CKO)是將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發育的某一特定階段，實現對小鼠基因組的時空特異性修飾[1,2]。CKO技術主要是通過染色體位點特異性重組酶系統來實現的，如Cre-LoxP系統[3,4]、FLP-Frt系統[5,6]和Dre-Rox系統[7]，其中最為常用的是Cre-LoxP系統，是在待敲除的一段目的DNA序列的兩端各放置一個LoxP序列，得到目的基因插入兩個LoxP位點 (flanked by loxP，Flox) 的小鼠。將Flox小鼠與特異性表達Cre的工具鼠交配，即可獲得具有組織或細胞特異性敲除目的的基因小鼠[8]。研究顯示，p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis-stimulating of p53 protein 2，ASPP2)在多種疾病的發生發展過程中起著重要的作用[9-15]。我們前期構建了ASPP2全身敲除小鼠，顯示可以促進二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘導的肝癌形成[16,17]。為了更好地研究ASPP2在肝臟疾病發病過程中的生物學功能和作用機制，我們利用簇狀規則間隔短回文重復序列/CRISPR相關蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9) 技術獲得 ASPP2-flox小鼠，與肝臟特異性表達Alb-Cre的小鼠交配繁育，構建ASPP2肝臟條件性基因敲除小鼠，為深入探討ASPP2在肝臟疾病(如肝癌、肝再生和脂肪肝形成等)發生發展過程中的作用提供了應用模型。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 12～16周齡SPF級Balbl/c小鼠，雌雄各半，共10只； 12～16周齡SPF級C57b6l/J Alb-Cre小鼠，雌雄各半，共10只，購自江蘇集萃藥康生物技術有限公司[生產許可證號：SYXK(蘇)2018-0008]，并在該公司SPF級動物房飼養和實驗[使用許可證號：SYXK(蘇)2018-0027]。所有小鼠飼養于12 h/12 h光照/黑暗條件下，自由采食和飲水，嚴格遵守首都醫科大學動物倫理和福利相關規定(倫理批件號：AEEI-2019-068)進行動物實驗。DH5a 感受態細胞(諾唯贊生物科技股份有限公司，中國)；MEGA short script Kit 試劑盒(Invitrogen， 美國)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，中國)；抗β-actin和抗ASPP2(Cell Signaling Technology，美國)。ProFlexTM 96-well PCR system(Applied Biosystems，美國)；DFC450 C正置顯微鏡(LEICA，德國)； ChemiDoc XRS化學發光成像系統(BioRad，美國)；PowerPacTMBasic電泳儀(BioRad，美國)。

1.2 ASPP2基因肝臟條件性敲除小鼠的構建策略 采用CRISPR/Cas9基因編輯法，以Balb/c近交系小鼠為背景鼠，按照圖1的示例，選擇ASPP2-201轉錄本 (ENSMUST00000117245.1) 為模板，在1～2號和3～4號外顯子區插入Loxp片段，以獲得 ASPP2-flox小鼠。

圖1 ASPP2肝臟條件性敲除小鼠的構建策略

1.3 載體的設計、構建和純化 使用麻省理工學院的CRISPR Design 工具(http://crispr.mit.edu/)，依據 Score 的高低設計一對長度為20 bp 的針對靶標 DNA 的寡聚核苷酸鏈序列，用于制備向導RNA (small guide RNA, sgRNA)，sgRNA序列見表1。根據 sgRNA 序列，設計一個攜帶靶位點同源區域和 Loxp 位點的重組質粒，并在該靶區域設計引物，用于后續小鼠的基因鑒定，鑒定策略見圖2，引物信息見表2(引物均由生工生物工程上海股份有限公司合成)，測序引物信息見表3，反應體系見表4。制作攜帶靶位點同源區域和LoxP 位點片段的重組質粒，將重組質粒轉化到DH5a 感受態細胞，通過氨芐青霉素抗性和插入片段測序，對陽性克隆質粒進行篩選和鑒定，挑選正確的菌落克隆，擴大培養后提取質粒并純化，獲得的片段產物用于注射使用。

表1 sgRNA序列

表2 ASPP2-flox小鼠鑒定引物

圖2 ASPP2肝臟條件性敲除小鼠基因型鑒定策略

野生型：聚合酶鏈式反應只獲得單一的243 bp或669 bp或754 bp條帶；雜合子：聚合酶鏈式反應獲得243 bp、330 bp或669 bp、423 bp或754 bp、399 bp條帶；純合子：聚合酶鏈式反應只獲得單一的330 bp或423 bp或399 bp條帶。

表3 測序引物序列

表4 聚合酶鏈式反應體系及條件

1.4 肝臟敲除ASPP2基因小鼠的獲得 將 sgRNA 表達載體線性化，經酚氯仿抽提純化，作為模板用于體外轉錄，并使用 MEGAshortscript Kit 體外合成 sgRNA。將轉錄好的 sgRNA 和 cas9 以及純化后的重組片段混合并調整濃度，使用顯微注射儀將混合物顯微注射到BALB/c小鼠受精卵，再將受精卵移植到假孕的 BALB/c 母鼠子宮，等待 ASPP2-flox F0 代小鼠出生。在 F0 代小鼠出生后 5～7 d，采用剪腳趾法標記小鼠，并剪取鼠尾組織，經酚氯仿法提取DNA，依據上述在靶區域設計的引物進行基因型鑒定，選取PCR檢測為雜合子表型的樣品進行測序。 將PCR檢測和測序正確的F0代小鼠與野生型BALB/c 小鼠進行交配，產生 F1代小鼠。采用上述鑒定方法對 F1 代小鼠進行基因型鑒定，并測序驗證，獲得的陽性 F1 代雜合子小鼠即可穩定地遺傳。將F1代ASPP2-flox小鼠與C57b6l/J Alb-Cre小鼠交配，獲得ASPP2fl/-CreT小鼠，用得到的該基因型小鼠與BALB/c 背景的ASPP2fl/-小鼠回交5代以上，得到BALB/c.B6J ASPP2fl/flCreT小鼠，即為肝臟敲除ASPP2基因的小鼠?；蛐蜋z測引物見表2和表5。

表5 Cre 鑒定引物

1.5 ASPP2基因肝臟條件性敲除小鼠肝臟蛋白表型表達檢測 取ASPP2fl/flCreT小鼠，采用脫頸椎處死，快速取得肝組織，將一部分肝組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，常規制備石蠟切片，采用免疫組化法(SP法)進行ASPP2蛋白表達檢測；將另一部分肝組織放入液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存，后期提取總蛋白，測蛋白濃度、電泳轉膜、封閉、抗體孵育，凝膠成像系統檢測ASPP2蛋白表達。

2 結果

2.1 ASPP2-flox基因型鑒定和測序結果 將F0代和F1代ASPP2-flox小鼠的鼠尾組織PCR產物進行瓊脂凝膠電泳，雜合子基因型小鼠可以獲得243 bp和330 bp(5'arm+wt)或669 bp和423 bp(5'arm)或754 bp和399 bp(3'arm)條帶。如61、63、66號小鼠即為F1代陽性雜合子(ASPP2fl/-，圖3)。進一步測序發現，loxp位點序列為ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT，說明61、63、66號小鼠是陽性雜合子小鼠無誤(圖4)，可供后續繁育。

圖3 ASPP2-flox小鼠 F1代基因型鑒定P:陽性對照；WT：野生型對照；N：陰性對照；M：分子量標準

圖4 ASPP2-flox小鼠 F1代鼠尾組織基因測序鑒定結果A和B：5’端測序結果；C：3’端測序結果為測序位點

2.2 ASPP2肝臟條件性敲除(ASPP2fl/flCreT)鑒定情況 將ASPP2fl/flCreT小鼠的鼠尾組織PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，檢測ASPP2基因：Flox/flox(fl/fl) 基因型小鼠顯示為330 bp和399 bp單一條帶，即311、312、316、320、322、325、326；Flox/wt(fl/wt)基因型小鼠顯示為243 bp和330 bp或745 bp和399 bp兩條帶，即313、314、317、319、32、323、327、328、329；其余小鼠為野生型，僅顯示為243 bp或745 bp條帶。檢測Alb-cre基因：Mut/wt基因型小鼠顯示為390 bp單一條帶，即為311、312、314、316、317、321、325、326、327、328、329；其余小鼠為野生型，顯示為351 bp條帶(圖5)。因此，311、312、316、325、326號小鼠為ASPP2fl/flCreT小鼠(顯示為330、399、390 bp條帶)，即肝臟特異敲除的小鼠模型。

圖5 ASPP2肝臟條件性敲除(ASPP2fl/fl CreT)小鼠基因型鑒定結果A：243 bp和330 bp條帶；B：754 bp和399 bp條帶；C：351 bp條帶；D：390 bp條帶;P:為陽性對照；B6：陰性對照(B6小鼠基因組DNA)；N：無模板的對照;M: DL2000 分子量標記，2000 bp/1000 bp/750 bp/500 bp/250 bp/100 bp

2.3 ASPP2基因肝臟條件性敲除小鼠肝組織ASPP2蛋白表達情況 經Western blot檢測顯示，與野生小鼠比，ASPP2fl/flCreT小鼠肝組織ASPP2蛋白表達顯著減弱(圖6A)；經免疫組化檢測顯示，ASPP2主要表達于肝細胞核。與野生小鼠比，ASPP2fl/flCreT小鼠肝組織ASPP2陽性細胞數顯著減少(圖6B)。

圖6 ASPP2基因肝臟條件性敲除小鼠肝組織ASPP2蛋白表達A：Western blot法檢測ASPP2蛋白表達；B：ASPP2蛋白主要表達于細胞核(SP法，200×)

3 討論

基因敲除包括全身性基因敲除和條件性基因敲除兩種方法，其中全身性基因敲除是指在小鼠所有組織細胞，將靶基因敲除掉，從而使靶基因的表達缺失[18,19]。本文所提及的基因條件性敲除是利用Cre-Loxp 重組系統，將 Cre 基因插入特定的啟動子序列后面，即可人為地控制 Cre 基因在某些細胞譜系或者在機體發育的特定時間段抑或在外源性藥物誘導下表達，表達的 CRE 蛋白識別特定的 DNA序列 (如 Loxp 位點)，并進行 Loxp 位點之間的靶基因剪切，從而實現目的基因在特定細胞類型中功能性缺失[20]。

本研究利用CRISPR/Cas9 技術，通過同源重組的原理，對ASPP2靶基因進行flox 修飾，即在ASPP2基因2、3外顯子兩側插入Loxp序列，構建ASPP2-flox小鼠。該flox 小鼠與肝臟特異性的Cre 工具鼠(Alb-Cre)交配后，可獲得肝臟特異性敲除ASPP2基因的小鼠。本研究采用了PCR對F0代和F1代ASPP2-flox小鼠的基因型進行了檢測，顯示為243 bp和330 bp (5'arm+wt)或669 bp和423 bp(5'arm)或754 bp和399 bp(3'arm)條帶，基因型為ASPP2fl/-，測序結果顯示loxp位點序列為ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT，提示ASPP2-flox 雜合小鼠模型構建成功。F1代雜合小鼠與Alb-Cre小鼠進行雜交后，回交ASPP2 fl/-小鼠，得到基因型為ASPP2fl/flCreT的小鼠，即得到ASPP2肝臟條件性敲除小鼠，PCR檢測基因結果顯示為30 bp、399 bp和390 bp條帶。經Westernblot和免疫組化法檢測顯示ASPP2fl/flCreT小鼠肝臟ASPP2 蛋白表達顯著減弱。

綜上所述，基因型、測序和蛋白表達分析結果均顯示基于Cre-LoxP系統成功構建了ASPP2基因肝臟條件性敲除小鼠，該模型可以為下一步研究ASPP2在肝病發生過程中的作用提供模型基礎。