miR-191及miR-886-5p在肺結核外周血中的表達與臨床價值研究*

朱雄林，楊 梅，馮顯紅，李小林，章革民

(1.武漢市新洲區人民醫院感染科 430400；2.武漢市新洲區婦幼保健院婦產科 430400；3.武漢市新洲區人民醫院檢驗科 430400；4.武漢市新洲區人民醫院心內科 430400)

結核分枝桿菌感染后可導致肺結核，該疾病屬于慢性傳染病，使傳染病中導致死亡的首要原因，嚴重危害身體健康和生存質量。每年因肺結核死亡的人數高達300萬[1]，而我國更是該疾病高發的國家，發病率居世界前5位。因此，尋找與肺結核相關的基因從而快速診斷肺結核，對有效控制肺結核的傳染具有重要臨床意義。

miRNAs 是真核生物內源性非編碼RNA，可對基因表達進行調節，從而影響細胞的分化、增殖、凋亡和免疫應答等多方面。例如miR-20a-5p、miR-181a-5p等被證明與肺結核的發病具有相關性，但目前關于miR-191、miR-886-5p是否與肺結核的發病有關的研究仍較少。因此，本研究探討肺結核患者miR-191、miR-886-5p的表達情況，以及其與肺結核診斷的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年8月在武漢市新洲區人民醫院就診的傳染病科確診為肺結核的患者50例作為結核組，潛伏感染結核桿菌的患者50例作為潛在感染組，選取同期在武漢市新洲區人民醫院體檢的健康者50例作為對照組。肺結核診斷標準符合《中華人民共和國衛生行業標準肺結核診斷標準》(WS 288-2017)[2]。所有患者均知情同意。肺結核診斷標準：(1)至少1次痰細菌學檢查為陽性(包括痰涂片或痰培養)；(2)胸部X線片檢查有典型的活動性結核病變；(3)肺組織病理學診斷為結核病變；(4)疑似肺結核病患者，隨訪觀察后抗結核藥物治療有效。符合上述項目之一者即可確診為肺結核。潛伏感染者：是機體對結核分支桿菌抗原刺激產生持續的免疫應答但無明顯活動性結核病表現的患者。感染者沒有結核病的任何癥狀和體征，痰等各種標本抗酸染色涂片和培養均為陰性，影像學檢查正常。排除標準：(1)合并嚴重肝臟、腎臟、心臟、血液疾病的患者；(2)腫瘤患者；(3)HIV、高血壓、糖尿病等慢性疾病的患者。

1.2 方法

血液樣本采集:3組受試者于入組后次日清晨采集2 mL空腹靜脈血置于肝素鈉處理的抗凝管中，混勻后-80 ℃保存。血漿 miRNA 提取:采用RNA試劑盒提取循環 RNA，用Thermo 核酸檢測儀測定產物純度。將提取的各種miRNA 儲存于-80 ℃以防降解。miRNA 表達水平的檢測:采用miRNA檢測試劑盒按照說明書配置相應反應體系，將反應底物∶逆轉錄引物∶酶(1∶1∶1)混勻后加入 miRNA 模板，離心后收集反應產物。PCR逆轉錄合成 cDNA，反應條件設置為 40 ℃ 62 min，85 ℃ 8 min。將cDNA稀釋后采用qPCR法檢測Ct 值。將cDNA置于-20 ℃保存。以cDNA 為模板進行PCR芯片檢測。將聚合酶、PCR引物、反應底物、熒光染料置于反應體系中，混勻后移取模板 cDNA，將96孔qPCR芯片在室溫條件下平衡好后，上樣。采用ABI3500 熒光定量 PCR儀進行檢測，反應條件設置為 90 ℃ 10 min，90 ℃變性15 s，63 ℃ 退火15s，75 ℃延伸15 s，40個循環，并在延伸階段進行熒光檢測，然后定量計算miR-191、miR-886-5p的表達水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 一般資料比較

3組患者一般資料包括年齡、性別、吸煙、飲酒例數差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組患者一般資料比較(n=50)

2.2 患者miR-191、miR-886-5p表達水平比較

與對照組相比，潛在感染組、結核組患者miR-191水平顯著降低，其中結核組患者miR-191水平最低，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，潛在感染組、結核組患者miR-886-5p水平顯著升高，其中結核組患者miR-886-5p水平最高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 肺結核患者miR-191、miR-886-5p表達與臨床病理特征的關系

根據肺結核患者miR-191、miR-886-5p表達水平將患者分為低表達、高表達，分析其與臨床病理特征的關系。結果表明，miR-191、miR-886-5p表達水平與肺部病灶個數、空洞個數均有顯著相關性(P<0.05)，與年齡、性別均無相關性(P>0.05)，見表3。

表2 3組患者miR-191、miR-886-5p表達水平比較

表3 肺結核患者miR-191、miR-886-5p表達量與臨床病理特征的關系(n)

2.4 肺結核患者miR-191、miR-886-5p表達與年齡、性別、肺部病灶個數、空洞個數的Person相關性分析

經Person相關性分析，miR-191、miR-886-5p表達與年齡(r=0.124、0.153,P>0.05)、性別(r=0.119、0.174,P>0.05)無明顯相關性；與肺部病灶個數(r=-0.265、0.248,P<0.05)、空洞個數(r=0.245、0.261,P<0.05)具有相關性。

2.5 miR-191、miR-886-5p診斷的ROC曲線分析

以結核組、潛伏感染組的miR-191、miR-886-5p的表達水平為檢驗變量，對照組為效應變量。ROC曲線顯示miR-191的靈敏度為60.4%，特異度為74.0%，曲線下面積為0.699(P<0.05)。miR-886-5p的靈敏度為77.1%，特異度為66.7%，曲線下面積為0.751(P<0.05)。ROC曲線表明miR-191、miR-886-5p在診斷肺結核都有意義，miR-191、miR-886-5p聯合診斷時，靈敏度為80.2%，特異度為79.8%(P<0.05)，見圖1、表4。

2.6 肺結核相關因素的logistic回歸分析

將肺結核作為因變量，將年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、miR-191、miR-886-5p作為自變量，構建logistic回歸分析模型，結果表明，miR-191、miR-886-5p是肺結核發生的影響因素，見表5。

表4 miR-191、miR-886-5p診斷的ROC曲線分析

圖1 miR-191、miR-886-5p診斷的ROC曲線

表5 肺結核相關因素的logistic回歸分析

3 討 論

機體感染結核分枝桿菌后，各個器官被結核分枝桿菌侵襲，但主要侵襲患者肺部發展為肺結核，患者可伴有全身乏力、咳嗽、咳血等癥狀，機體免疫力極度低下，嚴重者可致死亡[3]。由于肺結核的傳染性較強，且耐藥型結核菌大量出現，給肺結核的治療帶來極大困難，但若能早期診斷肺結核，及時控制肺結核的傳播，可大大降低肺結核的感染率。

研究表明，miRNA可直接或間接調控靶基因，參與細胞周期、增殖、凋亡等過程，在微生物感染、機體免疫應答、炎性反應等過程中發揮重要作用[4]。例如，miR-150 通過調控PDCD4可對結核分枝桿菌H37Rv感染THP-1巨噬細胞的炎癥、細胞增殖及凋亡發揮作用[5]；miR-191可通過調節炎癥因子反應而參與砷暴露患者的腎功能障礙[6]。研究發現，活動性肺結核患者中miR-155的表達量增加了3.7倍[7]；miR-155是結核桿菌介導巨噬細胞凋亡中所必需的成分[8]。人血清中miR-361-5p、miR-889、miR-576-3p的表達量在肺結核患者中顯著增高[9]。

本研究結果表明，與對照組相比，結核組患者miR-191表達水平最低(P<0.05)。結核組患者miR-886-5p水平顯著高于潛在感染組及對照組(P<0.05)。對臨床病理特征進行分析發現，肺結核患者miR-191、miR-886-5p表達水平與肺部病灶個數、空洞個數呈明顯相關性(P<0.05)，與年齡、性別無相關性(P>0.05)。當機體感染結核分枝桿菌時，患者免疫力下降，結核菌大量繁殖后超出宿主細胞的免疫控制能力，導致肺部組織壞死，臨床表現為肺部空洞，當結核分枝桿菌快速生長時，感染越嚴重時，可加速對細胞外基質的降解，利于肺部空洞的形成，而分子水平則表現為miR-191降低、miR-886-5p高于對照組。Logistic回歸分析表明miR-191、miR-886-5p是肺結核發生的影響因素。根據相關研究，miR-191位于染色體3p21.31，其異常表達與糖尿病、肺動脈高壓、炎性反應等的發生具有相關性[10-11]。miR-191通過靶向抑制TIMP3激活基質金屬蛋白酶2(MMP2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等癌基因導致肺癌細胞惡化[12]。因此，本研究推測miR-191、miR-886-5p可能通過抑制相關翻譯基因的表達，如MMP2、JNK等，而導致肺結核的發生與發展。研究表明，部分miRNA可通過調節熱休克蛋白的表達水平而使結核分枝桿菌滯留于巨噬細胞內，進而逃逸機體對其的免疫殺傷作用[13]。例如，miRNA-130b通過與miRNA-3-UTR結合而抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的基因轉錄，從而明顯降低其蛋白表達水平，同時還可抑制M2型巨噬細胞成熟，明顯降低炎性細胞因子的分泌[14]。因此，miR-191、miR-886-5p也可能通過調節熱休克蛋白的表達而使結核桿菌滯留于巨噬細胞內進而引發肺結核的發生。

相關研究發現，大部分miRNA可介導慢性炎性反應，包括結核病。如miR-223通過調控肺部髓樣細胞分泌的趨化因子CXC酶體2(CXCL2)、白細胞介素(IL)-6等水平而調控慢性炎癥，如結核病等[15-16]。注射卡介苗后，核因子(NF)-κB信號通路被激活，進而誘導miR-21的表達，miR-21作用于IL-12p35抑制IL-12的產生進而損傷T細胞的免疫反應。miR-886-5p在肺結核患者表達上調，推測miR-886-5p可能與炎性反應有關，通過靶作用于程序性細胞死亡而調節免疫反應[17]。本研究ROC曲線表明miR-191、miR-886-5p在診斷肺結核都有意義，miR-191、miR-886-5p聯合診斷時靈敏度和特異度均高于二者單獨診斷，二者聯合診斷的靈敏度為80.2%，特異度為79.8%(P<0.05)。

由此可見，肺結核患者miR-191、miR-886-5p分子的差異性表達，可較好反映機體感染結核桿菌后機體發生的免疫應答，可作為判斷肺結核嚴重程度的生物標志物。